கொரோனா வைரஸ் பிரதி-டிரான்ஸ்கிரிப்ஷன் வளாகம்: NSP9 இல் பாதுகாக்கப்பட்ட தளங்களுக்கு NiRAN-RdRp துணைக்குழுக்களின் முக்கியமான மற்றும் தேர்ந்தெடுக்கப்பட்ட NMPylation

பீட்டர் சர்னோவால் திருத்தப்பட்டது, ஸ்டான்போர்ட் யுனிவர்சிட்டி ஸ்கூல் ஆஃப் மெடிசின், ஸ்டான்போர்ட் பல்கலைக்கழகம், கலிபோர்னியா, டிசம்பர் 25, 2020 அன்று அங்கீகரிக்கப்பட்டது (அக்டோபர் 25, 2020 அன்று மதிப்பாய்வு செய்யப்பட்டது)

கொரோனா வைரஸ்கள்-டிரான்ஸ்கிரிப்ஷன் வளாகங்களின் பிரதியெடுப்பில் துணைக்குழுக்களுக்கு இடையிலான தொடர்புகளை நாங்கள் புகாரளிக்கிறோம், அவை நகலெடுப்பதற்கும் பரிணாமப் பாதுகாப்பிற்கும் அவசியம்.nsp12 உடன் தொடர்புடைய NiRAN டொமைன் டிரான்ஸ்ஸில் நியூக்ளியோசைட் மோனோபாஸ்பேட் (NMP) பரிமாற்ற செயல்பாட்டைக் கொண்டுள்ளது என்பதற்கான ஆதாரங்களை நாங்கள் வழங்கினோம், மேலும் அதன் இலக்காக nsp9 (ஒரு RNA பிணைப்பு புரதம்) அடையாளம் காணப்பட்டது.Mn2+ அயனிகள் மற்றும் அருகில் உள்ள பாதுகாக்கப்பட்ட Asn எச்சங்களை நம்பியிருக்கும் எதிர்வினையில் பாதுகாக்கப்பட்ட nsp9 அமினோ டெர்மினஸுடன் NMP பகுதியின் கோவலன்ட் இணைப்பிற்கு NiRAN ஊக்கமளிக்கிறது.கொரோனா வைரஸ் நகலெடுப்பதற்கு NiRAN செயல்பாடு மற்றும் nsp9 NMPylation அவசியம் என்று கண்டறியப்பட்டது.RNA வைரஸ்களின் ஒரு வகுப்பில் RNA தொகுப்பின் துவக்கம் செயல்பாட்டு ரீதியாகவும் பரிணாம ரீதியாகவும் ஒத்துப்போகிறது என்ற கருதுகோளில் உள்ள முந்தைய அவதானிப்புகளுடன் உள்ளமை வைரஸ் நொதி மார்க்கரின் இந்தச் செயல்பாட்டை இணைக்க தரவு அனுமதிக்கிறது.

Nidovirales (Coronaviridae, Arterioviridae மற்றும் 12 பிற குடும்பங்கள்) RNA-சார்ந்த RNA பாலிமரேஸ் (RdRps) ஆனது NiRAN எனப்படும் பாலிபுரோட்டீனில் இருந்து வெளியாகும் கட்டமைப்பு அல்லாத புரதத்தில் (nsp) அமினோ-டெர்மினல் (N-டெர்மினல்) டொமைனுடன் இணைக்கப்பட்டுள்ளது. 1ab வைரஸ் முக்கிய புரோட்டீஸ் (Mpro) ஆனது.முன்னதாக, தமனி வைரஸ் NiRAN-RdRp nsp இன் சொந்த GMPylation/UMPylation செயல்பாடு தெரிவிக்கப்பட்டது, மேலும் நியூக்ளியோசைட் மோனோபாஸ்பேட் (NMP) ஐ (தற்போது அறியப்படாத) வைரஸ் மற்றும்/அல்லது செல் பயோபாலிமரைசேஷன் விஷயங்களுக்கு மாற்றுவதற்கு ஒரு நிலையற்ற தன்மையை உருவாக்க பரிந்துரைக்கப்பட்டது.இங்கே, கொரோனா வைரஸ் (Human Coronavirus [HCoV]-229E மற்றும் Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus 2) nsp12 (NiRAN-RdRp) Mn2+-சார்ந்த NMPylation செயல்பாட்டைக் கொண்டுள்ளது, இது Mpro-மத்தியஸ்தம் செய்யப்பட்ட பிறகு nsp9 உருவாவதன் மூலம் nsp9 இலிருந்து பெறப்படுகிறது. N-டெர்மினல் பக்கவாட்டு nsps புரோட்டியோலிடிகல் முறையில் வெளியிடப்படுகிறது, பாஸ்போராமைடேட் nsp9 இன் N-முனையத்தில் முதன்மை அமினுடன் (N3825) பிணைக்கப்பட்டுள்ளது.இந்த வினையில் யூரிடின் ட்ரைபாஸ்பேட் விரும்பத்தக்க நியூக்ளியோடைடு ஆகும், ஆனால் அடினோசின் ட்ரைபாஸ்பேட், குவானோசின் ட்ரைபாஸ்பேட் மற்றும் சைடிடின் ட்ரைபாஸ்பேட் ஆகியவையும் பொருத்தமான இணை-அடி மூலக்கூறுகளாகும்.மறுசீரமைப்பு கொரோனா வைரஸ் nsp9 மற்றும் nsp12 புரதங்கள் மற்றும் மரபணு பொறிக்கப்பட்ட HCoV-229E மரபுபிறழ்ந்தவர்களைப் பயன்படுத்தி பிறழ்வு ஆய்வுகள் NiRAN-மத்தியஸ்தம் nsp9 NMPylation மற்றும் செல் கலாச்சாரத்தில் வைரஸ் பிரதிபலிப்புக்குத் தேவையான எச்சங்களைத் தீர்மானித்தன.தரவு NiRAN செயலில் உள்ள தள எச்சங்களின் கணிப்பை உறுதிப்படுத்தியது மற்றும் nsp9 NMPylation மற்றும் விட்ரோவில் வைரஸ் பிரதிபலிப்பு ஆகியவற்றில் nsp9 N3826 எச்சங்களின் முக்கிய பங்கை தீர்மானித்தது.இந்த எச்சம் பாதுகாக்கப்பட்ட N-டெர்மினல் NNE டிரிப்டைட் வரிசையின் ஒரு பகுதியாகும், மேலும் இது கொரோனா வைரஸ் குடும்பத்தில் nsp9 மற்றும் அதன் ஹோமோலாஜ்களின் ஒரே மாறாத எச்சம் என நிரூபிக்கப்பட்டுள்ளது.இந்த ஆய்வு மற்ற உள்ளமை வைரஸ்களின் NMPylation செயல்பாட்டின் செயல்பாட்டு ஆய்வுக்கு உறுதியான அடித்தளத்தை வழங்குகிறது மற்றும் வைரஸ் தடுப்பு மருந்துகளின் வளர்ச்சிக்கான சாத்தியமான இலக்குகளை முன்மொழிகிறது.

நிடோவைரல்ஸ் பாசிட்டிவ்-ஸ்ட்ராண்டட் ஆர்என்ஏ வைரஸ் பல்வேறு முதுகெலும்புகள் மற்றும் முதுகெலும்பில்லாத உயிரினங்களை பாதிக்கிறது (1, 2).இந்த உத்தரவில் தற்போது 14 குடும்பங்கள் (3) அடங்கும், அதில் கொரோனா வைரஸ் குடும்பம் கடந்த 20 ஆண்டுகளில் விரிவாக ஆய்வு செய்யப்பட்டுள்ளது.அந்த நேரத்தில், மூன்று ஜூனோடிக் கொரோனா வைரஸ்கள் விலங்கு புரவலர்களிடமிருந்து வெளிவந்தன மற்றும் மனிதர்களுக்கு கடுமையான சுவாச நோய்த்தொற்றுகளின் பெரிய அளவிலான வெடிப்பை ஏற்படுத்தியது.கடுமையான கடுமையான தொற்று நோய்களால் ஏற்படும் தொடர்ச்சியான தொற்றுநோய்கள் உட்பட.சுவாச நோய்க்குறி கொரோனா வைரஸ் 2 (SARS-CoV-2) (4âââ7).Nidoviruses ஒரு பொதுவான மரபணு அமைப்பைப் பகிர்ந்து கொள்கின்றன, மேலும் சவ்வு-பிணைக்கப்பட்ட பிரதி-டிரான்ஸ்கிரிப்ஷன் வளாகத்தின் (RTC) துணைப்பிரிவு 5-?²-மூன்றில் இரண்டு பங்கு முனையத்திலும், வைரஸ் துகளின் முக்கிய கட்டமைப்பு துணைக்குழுவிலும் மற்றும் சில துணைப் பொருட்களிலும் குறியாக்கம் செய்யப்பட்டுள்ளது. .புரதம், மரபணுவின் 3??² இறுதி மூன்றில் குறியிடப்பட்டது (1).பிளானேரியன் வைரஸ்களின் ஒரு குடும்பத்தைத் தவிர (மோனோவிரிடே) (8), அனைத்து உள்ளமை வைரஸ்களும் RTC துணைப்பிரிவுகளை இரண்டு பெரிய திறந்த வாசிப்பு பிரேம்களில் (ORF) ORF1a மற்றும் ORF1b ஆகியவற்றில் குறியாக்கம் செய்கின்றன, அவை மரபணு RNA இலிருந்து மொழிபெயர்க்கப்படுகின்றன.ORF1a பாலிபுரோட்டீன் (pp) 1a ஐ குறியாக்குகிறது, மேலும் ORF1a மற்றும் ORF1b கூட்டாக pp1ab ஐ குறியாக்குகிறது.ORF1a ஆல் குறியிடப்பட்ட பிரதான புரோட்டீஸின் (Mpro) பொதுப் பங்கேற்புடன், pp1a மற்றும் pp1ab இரண்டும் புரோட்டியோலிட்டிகல் முறையில் பல்வேறு கட்டமைப்பு அல்லாத புரதங்களாக (nsps) செயலாக்கப்படுகின்றன, இது 3CLpro என்றும் அழைக்கப்படுகிறது, ஏனெனில் இது பைகார்னாவைரஸின் 3Cpro உடன் ஹோமோலஜியைக் கொண்டுள்ளது ( 9)இந்த nsps ஒரு பெரிய டைனமிக் RTC யில் இணைக்கப்பட்டதாக கருதப்படுகிறது, மரபணு RNA (பிரதிப்படுத்தல்) மற்றும் துணை மரபணு RNA (டிரான்ஸ்கிரிப்ஷன்) ஆகியவற்றின் தொகுப்புக்கு ஊக்கமளிக்கிறது, மேலும் ORF1b இன் கீழ்நிலையில் அமைந்துள்ள ORF இன் வெளிப்பாட்டை ஒருங்கிணைக்கப் பயன்படுகிறது (10? ? ?12).

முக்கிய RTC ஆனது RNA-சார்ந்த RNA பாலிமரேஸ் (RdRp) (13), சூப்பர்ஃபாமிலி 1 ஹெலிகேஸ் (HEL1) (14, 15) மற்றும் பல RNA செயலாக்க என்சைம்களை உள்ளடக்கியது, இவை முக்கியமாக ORF1b மற்றும் கொரோனா வைரஸ் குடும்பத்தில் குறியிடப்பட்டவை இதில் nsp12-nsp16 மற்றும் ஆர்டெரியோவிரிடே குடும்பத்தில் nsp9-nsp12 (குறிப்பு 10ââ 12 ஐப் பார்க்கவும்).RdRp மற்றும் HEL1 ஆகியவை பறவையின் கூடு வைரஸின் இரண்டு (ஐந்தில் ஒரு பங்கு) பாதுகாக்கப்பட்ட டொமைன்களைக் குறிக்கின்றன மற்றும் பிற RNA வைரஸ்கள் மத்தியில் ஹோமோலஜியைக் கொண்டுள்ளன.pp1a இன் கார்பாக்சி-டெர்மினல் (C-டெர்மினல்) பகுதியிலிருந்து, Mpro (கொரோனா வைரஸ் nsp5 மற்றும் தமனி வைரஸ் nsp4, முறையே) கீழ்நோக்கி வெளியிடப்பட்ட பல சிறிய nsps உட்பட, பிற துணைக்குழுக்களால் கோர் பிரதிகள் உதவுவதாக நம்பப்படுகிறது.அவர்கள் வரையறுக்கப்பட்ட குடும்ப-குறிப்பிட்ட பாதுகாப்பு மற்றும் பல்வேறு செயல்பாடுகளைக் கொண்டுள்ளனர் (குறிப்பு 10ââ12 இல் மதிப்பாய்வு செய்யப்பட்டது).

ஒப்பீட்டளவில் சமீபத்தில், அனைத்து உள்ளமை வைரஸ்களிலும் RdRp க்கு அருகில் உள்ள அமினோ டெர்மினஸில் (N-டெர்மினஸ்) தனித்துவமான வரிசை மையக்கரு பண்புகளைக் கொண்ட ஒரு டொமைன் கண்டறியப்பட்டது, ஆனால் வேறு எந்த RNA வைரஸ்களும் இல்லை (16).அதன் இருப்பிடம் மற்றும் நியூக்ளியோடைடு பரிமாற்றம் (நியூக்ளியோசைட் மோனோபாஸ்பேட் [NMP] பரிமாற்றம்) செயல்பாட்டின் அடிப்படையில், இந்த டொமைனுக்கு NiRAN (Nestvirus RdRp- தொடர்பான நியூக்ளியோடைடு பரிமாற்றம்) என்று பெயரிடப்பட்டது.NiRAN-RdRp இன் இரட்டை-டொமைன் கலவையானது கொரோனாவிரிடே குடும்பத்தில் nsp12 மற்றும் ஆர்டெரியோவிரிடே குடும்பத்தில் nsp9 மற்றும் பிற நெஸ்டோவிரிடேகளில், NiRAN-RdRp ஆனது வைரஸ் பாலிபுரோட்டீனில் இருந்து ஒரு சுயாதீன nsp ஆக வெளியிடப்படும் என எதிர்பார்க்கப்படுகிறது.கொரோனா வைரஸில், NiRAN டொமைனில் ??1/450 எச்சங்கள் உள்ளன மற்றும் இணைப்பான் பகுதி (16.19) மூலம் C-டெர்மினல் RdRp டொமைனுடன் இணைக்கப்பட்டுள்ளது.Equine Arteritis Virus (EAV) (Arteriviridae) இல், மறுசீரமைப்பு nsp9 Mn2+ அயனி சார்ந்த (சுய) UMPylation மற்றும் GMPylation செயல்பாடுகளைக் காட்டுகிறது, இது நெஸ்டோவைரஸ், AN, BN மற்றும் CN ஆகியவற்றில் உள்ள மூன்று பாதுகாக்கப்பட்ட வரிசைத் தளங்களைப் பொறுத்தது.N என்பது NiRAN ஐக் குறிக்கிறது (16).இந்த மையக்கருத்துகளின் N-முனையப் பக்கமானது குறைவான பழமைவாத மையக்கருத்து preAN ஆகும்.இந்த எச்சங்களில் சில தொலைதூர தொடர்புடைய புரோட்டீன் கைனேஸ்களிலும் பாதுகாக்கப்படுகின்றன, அங்கு அவை நியூக்ளியோசைட் ட்ரைபாஸ்பேட் (NTP) பிணைப்பு மற்றும் வினையூக்க செயல்பாட்டில் (20, 21) ஈடுபடுவதாகக் காட்டப்பட்டுள்ளது.இந்தக் கவனிப்புக்கு இணங்க, சூடோமோனாஸ் சிரிங்கேயிலிருந்து சூடோகினேஸ் செலோவில் உள்ள பல முக்கிய செயலில் உள்ள தள எச்சங்கள் சமீபத்தில் வெளியிடப்பட்ட SARS-CoV-2 nsp7/8/12/13 சூப்பர் காம்ப்ளெக்ஸுடன் இணைக்கப்படலாம்.எலக்ட்ரான் நுண் கட்டமைப்பில் பாதுகாக்கப்பட்ட கொரோனா வைரஸ் NiRAN எச்சங்கள்.மறுசீரமைப்பு புரதம் (17).ஆவணப்படுத்தப்பட்ட (சுய) U/GMPylation NMPயை (தற்போது அறியப்படாத) அடி மூலக்கூறுக்கு (16) மாற்றுவதற்கு ஒரு நிலையற்ற நிலையை உருவாக்கும் என்று ஊகிக்கப்படுகிறது, மேலும் NiRAN மற்றும் புரோட்டீன் கைனேஸ் (17, 19) ஆகியவற்றுக்கு இடையேயான கட்டமைப்பு ஒற்றுமை (17, 19) ) என்பது கருதுகோள். NiRAN மற்ற புரதங்களை மாற்றியமைக்கிறது.

உள்ளமை வைரஸ்கள் மற்றும் RdRp இலிருந்து அதன் தனித்துவமான மற்றும் தனித்துவமான முறையான தொடர்பு உட்பட பல அம்சங்கள், NiRAN ஐ உள்ளமை வைரஸ்களுக்கான நியாயமான முக்கிய ஒழுங்குமுறை நொதியாக ஆக்குகின்றன, இது அவற்றின் தோற்றம் மற்றும் அடையாளத்திற்கு முக்கியமானது.முன்னதாக, ஜீனோம்/சப்ஜெனோமிக் மொழிபெயர்ப்பு அல்லது ரெப்ளிகேஷன்/டிரான்ஸ்கிரிப்ஷனைக் கட்டுப்படுத்த NiRAN சம்பந்தப்பட்ட மூன்று சாத்தியமான செயல்பாடுகள் அழைக்கப்பட்டன.அந்த நேரத்தில் கிடைக்கக்கூடிய பற்றாக்குறை மற்றும் முழுமையற்ற தரவைக் கருத்தில் கொள்ளும்போது, ​​ஒவ்வொரு செயல்பாட்டிற்கும் அதன் நன்மைகள் மற்றும் தீமைகள் உள்ளன (16).இந்த ஆராய்ச்சியில், இரண்டு வகைகளைக் குறிக்கும் கொரோனா வைரஸ்களின் உயிர்வேதியியல் மற்றும் தலைகீழ் மரபணு ஆய்வுகளை ஒன்றிணைத்து, இந்த மர்மமான சாம்ராஜ்யத்தைப் பற்றிய நுண்ணறிவைப் பெற, கொரோனா வைரஸ் குடும்பத்தின் இயற்கையான பிறழ்வின் பரிணாம பின்னணியில் எங்கள் கண்டுபிடிப்புகளை வைப்பதை நோக்கமாகக் கொண்டுள்ளோம்.RTC இல் இயற்கையான இலக்குகளை அடையாளம் காண்பதன் மூலம் NiRAN இன் புரிதலில் முக்கிய முன்னேற்றங்களை நாங்கள் தெரிவிக்கிறோம், இது (கிடைக்கும் மூன்று கருதுகோள்களில்) உள்ளமை வைரஸ் RNA இன் தொகுப்பைத் தொடங்குவதில் இந்த டொமைனின் பங்கிற்கு பங்களிக்கிறது.இந்த ஆராய்ச்சி வைரஸ் ஹோஸ்ட் இடைமுகத்தில் NiRAN இன் பிற பாத்திரங்களுக்கான சாத்தியக்கூறுகளையும் திறக்கிறது.

கொரோனா வைரஸ் nsp12-தொடர்புடைய NiRAN டொமைனின் நொதிப் பண்புகளை வகைப்படுத்துவதற்காக, மனித கொரோனா வைரஸ் 229E (HCoV-229E) nsp12 இன் மறுசீரமைப்பு வடிவத்தை E. coli இல் தயாரித்தோம், C-டெர்மினஸில் His6 குறிச்சொல்லைக் கொண்டு, அதை இணைத்தோம். [α32-P ] கொண்ட புரதம், பொருட்கள் மற்றும் முறைகளில் விவரிக்கப்பட்டுள்ளபடி MnCl2 முன்னிலையில் NTP உடன் இணைந்து அடைகாக்கும்.எதிர்வினை தயாரிப்பின் பகுப்பாய்வு, nsp12 (106 kDa) உடன் இணைந்து ரேடியோலேபிள் செய்யப்பட்ட புரதம் இருப்பதைக் குறிக்கிறது, இது கொரோனா வைரஸ் nsp12 கோவலன்ட் புரோட்டீன்-NMP சேர்க்கைகளை உருவாக்குவதற்கு ஊக்கமளிக்கிறது என்பதைக் குறிக்கிறது, முன்னுரிமை யூரிடின் மோனோபாஸ்பேட் (UMP) (படம் 1A) மற்றும் B).அளவு பகுப்பாய்வு மற்ற நியூக்ளியோடைடுகளுடன் ஒப்பிடும்போது, ​​UMP ஒருங்கிணைப்பின் சமிக்ஞை தீவிரம் 2 முதல் 3 மடங்கு அதிகரித்துள்ளது (படம் 1C).இந்தத் தரவு கொரோனா வைரஸின் (16) NiRAN டொமைனின் கணிக்கப்பட்ட NMP பரிமாற்றச் செயல்பாட்டுடன் ஒத்துப்போகிறது, ஆனால் கொரோனா வைரஸ் மற்றும் தமனி வைரஸின் NiRAN டொமைனின் நியூக்ளியோடைடு விருப்பத்தேர்வுகள் வேறுபட்டவை என்பதைக் குறிக்கிறது.

HCoV-229E nsp12 இன் சுய-NMPylation செயல்பாடு.(A) HCoV-229E nsp12-His6 (106 kDa) நியமிக்கப்பட்ட [α-32P] NTP உடன் 6 mM MnCl2 முன்னிலையில் 30 நிமிடங்களுக்கு அடைக்கப்பட்டது (விவரங்களுக்கு பொருட்கள் மற்றும் முறைகளைப் பார்க்கவும்).எதிர்வினை தயாரிப்புகள் SDS-PAGE ஆல் பிரிக்கப்பட்டு Coomassie புத்திசாலித்தனமான நீல நிறத்தில் படிந்தன.(B) ரேடியோலேபிள் செய்யப்பட்ட புரதம் பாஸ்பரஸ் இமேஜிங் மூலம் காட்சிப்படுத்தப்படுகிறது.nsp12-His6 மற்றும் புரத மூலக்கூறு நிறை குறிப்பான்களின் நிலைகள் (கிலோடால்டன்களில்) A மற்றும் B இல் காட்டப்பட்டுள்ளன. (C) கதிரியக்க சமிக்ஞையின் தீவிரம் (சராசரி ± SEM) மூன்று சுயாதீன சோதனைகளிலிருந்து தீர்மானிக்கப்பட்டது.*பி≤0.05.சமிக்ஞை வலிமை (சதவீதம்) UTP உடன் தொடர்புடையது.

செல் கலாச்சாரத்தில் (16) EAV மற்றும் SARS-CoV ஆகியவற்றின் நகலெடுப்பிற்கு NiRAN தொடர்பான என்சைம் செயல்பாடுகள் இன்றியமையாததாகக் காட்டப்பட்டாலும், குறிப்பிட்ட NiRAN செயல்பாடு மற்றும் சாத்தியமான இலக்குகள் இன்னும் தீர்மானிக்கப்படவில்லை.NiRAN மற்றும் புரோட்டீன் கைனேஸ் போன்ற மடிப்புகள் (17, 22) கொண்ட புரதங்களின் குடும்பத்திற்கு இடையே சமீபத்தில் அறிவிக்கப்பட்ட கட்டமைப்பு ஒற்றுமை NiRAN மற்ற புரதங்களின் NMPylation வினையூக்குகிறது என்ற கருதுகோளை சோதிக்க தூண்டியது.HCoV-229E ORF1a (nsps 5, 7, 8, 9, 10) மூலம் குறியிடப்பட்ட கட்டமைப்பு சாராத புரதங்கள் உட்பட சாத்தியமான ஹோமோலோகஸ் இலக்குகளின் தொகுப்பை உருவாக்கினோம், ஒவ்வொன்றும் C-டெர்மினல் His6 டேக் (SI பின்னிணைப்பு, அட்டவணை S1) , மற்றும் இந்த புரதங்களை [α32-P] யூரிடின் ட்ரைபாஸ்பேட்டுடன் ([α32-P]UTP) nsp12 இன் முன்னிலையில் அல்லது இல்லாத நிலையில் அடைகாக்கவும்.ஈ.கோலியில் உற்பத்தி செய்யப்படும் போவின் சீரம் அல்புமின் மற்றும் MBP-LacZα இணைவு புரதம் ஆகியவை கட்டுப்பாடுகளாக செயல்பட்டன (படம் 2A, பாதைகள் 1 முதல் 7 வரை).ரேடியோலேபிள் செய்யப்பட்ட புரதமானது சோடியம் டோடெசில் சல்பேட்-பாலிஅக்ரிலாமைடு ஜெல் எலக்ட்ரோபோரேசிஸ் (SDS-PAGE) மற்றும் ஆட்டோரேடியோகிராஃபி மூலம் பகுப்பாய்வு செய்யப்பட்டது, மேலும் nsp12 மற்றும் nsp9 கொண்ட எதிர்வினையில் வலுவான கதிரியக்க சமிக்ஞை இருப்பது கண்டறியப்பட்டது.சிக்னலின் நிலை nsp9 இன் மூலக்கூறு நிறைக்கு ஒத்துள்ளது, இது nsp9 இன் nsp12-மத்தியஸ்த UMPylation (படம் 2B, தடம் 7) குறிக்கிறது.வேறு எந்த சோதனை புரதங்களும் UMPylated என்று கண்டறியப்படவில்லை, இது nsp9 என்பது nsp12 இன் ஒரு குறிப்பிட்ட அடி மூலக்கூறு என்று முடிவு செய்ய வழிவகுத்தது.படம் 1 இல் காட்டப்பட்டுள்ள சுய-NMPylation தரவுக்கு இணங்க, nsp12 ஆனது நான்கு NMPகளையும் nsp9 க்கு மாற்ற முடியும், இருப்பினும் செயல்திறன் வேறுபட்டது, UMP> அடினோசின் மோனோபாஸ்பேட் (AMP)> குவானோசின் மோனோபாஸ்பேட் (GMP)> சைடிடின் மோனோபாஸ்பேட் (CMP) ) ( படம்).3 ஏ மற்றும் பி).இந்த மதிப்பீட்டில் பயன்படுத்தப்படும் நிபந்தனைகளின் கீழ் (எதிர்வினை மற்றும் வெளிப்பாடு நேரத்தைக் குறைக்கவும், nsp12 இன் செறிவைக் குறைக்கவும்; பொருட்கள் மற்றும் முறைகள்), nsp12 இன் சுய-NMPylation கண்டறியப்படவில்லை (படம் 2B, லேன் 7 மற்றும் படம் 1B ஐ ஒப்பிடுக), இது ஒரு பயனுள்ள (மற்றும் பல சுற்றுகள்) UMP ஆனது nsp12 இலிருந்து nsp9க்கு மாற்றப்பட்டது.படம் 3C இல் காட்டப்பட்டுள்ளபடி UMP பரிமாற்றச் செயல்பாட்டிற்கு Mn2+ அயனிகளின் இருப்பு தேவைப்படுகிறது, அதே நேரத்தில் Mg2+ முன்னிலையில் குறைந்தபட்ச UMP பரிமாற்றச் செயல்பாடு மட்டுமே காணப்பட்டது, மேலும் சோதனை செய்யப்பட்ட மற்ற இரண்டு divalent cations முன்னிலையில் எந்தச் செயல்பாடும் இல்லை.சைடிடின் ட்ரைபாஸ்பேட் (CTP), குவானோசின் ட்ரைபாஸ்பேட் (GTP) மற்றும் அடினோசின் ட்ரைபாஸ்பேட் (ATP) (SI பின்னிணைப்பு, படம் S1) ஆகியவற்றைக் கொண்ட NMPylation மதிப்பீடுகளில் இதே போன்ற தரவுகள் பெறப்பட்டன.

nsp9 இன் HCoV-229E nsp12-மத்தியஸ்த UMPylation.HCoV-229E nsp12-Himdiated இன் UMPylation செயல்பாட்டை மதிப்பிடுவதற்கு தொடர்ச்சியான புரத அடி மூலக்கூறுகள் (போவைன் சீரம் அல்புமின், MBP-lacZα, மற்றும் HCoV-229E nsps வரிசைகள் ORF1a ஆல் குறியிடப்பட்ட C-டெர்மினல் His6 உடன் லேபிளிடப்பட்டது) பயன்படுத்தப்பட்டது. புரத.பொருட்கள் மற்றும் முறைகளில் விவரிக்கப்பட்டுள்ளபடி nsp12 இல்லாத (A) அல்லது முன்னிலையில் (B) 10 நிமிடங்களுக்கு [α-32P] UTP உடன் புரதத்தை அடைகாக்கவும்.A மற்றும் B இன் மேற்புறத்தில், Coomassie Brilliant Blue உடன் படிந்த SDS-பாலிஅக்ரிலாமைடு ஜெல் காட்டப்பட்டுள்ளது, மேலும் A மற்றும் B இன் கீழே, தொடர்புடைய ஆட்டோரேடியோகிராம்கள் காட்டப்பட்டுள்ளன.புரத மூலக்கூறு நிறை மார்க்கரின் நிலை (கிலோடால்டன்களில்) இடதுபுறத்தில் கொடுக்கப்பட்டுள்ளது.nsp12-His6 (B, top) இன் நிலை மற்றும் nsp12-His6 இன் அடைகாக்கும் போது nsp9-His6 (B, லேன் 7) உடன் காணப்பட்ட கதிரியக்க சமிக்ஞை ஆகியவை குறிப்பிடப்படுகின்றன, இது [α-32P]UMP முதல் nsp9-His6 வரை இருப்பதைக் குறிக்கிறது. (12.9 kDa), இது பரிசோதிக்கப்பட்ட மற்ற புரதங்களுக்கு கவனிக்கப்படவில்லை.

HCoV-229E NiRAN-மத்தியஸ்த உயிர்வேதியியல் மற்றும் nsp9 NMPylation இன் வைராலஜிக்கல் தன்மை.(A மற்றும் B) வினையில் பயன்படுத்தப்படும் நியூக்ளியோடைடு இணை அடி மூலக்கூறின் பங்கு.Nsp12-His6 மற்றும் nsp9-His6 ஆகியவை நிலையான NMPylation மதிப்பீட்டில் வெவ்வேறு [α-32P] NTP களின் முன்னிலையில் கலக்கப்பட்டு அடைகாக்கப்படுகின்றன.(A, top) Coomassie-stained nsp9-His6 SDS-PAGE ஆல் பிரிக்கப்பட்டது.(A, கீழே) ஜெல்லின் அதே பகுதியின் ஆட்டோரேடியோகிராஃப்.(B) நியமிக்கப்பட்ட நியூக்ளியோடைடு கோஃபாக்டரின் முன்னிலையில் தொடர்புடைய செயல்பாடு (சராசரி ± SEM) மூன்று சுயாதீன சோதனைகளிலிருந்து தீர்மானிக்கப்படுகிறது.*பி≤0.05.(C) உலோக அயனிகளின் பங்கு.[α-32P] UTP மற்றும் வெவ்வேறு உலோக அயனிகளின் முன்னிலையில் நிலையான NMPylation சோதனை காட்டப்பட்டுள்ளது, ஒவ்வொன்றும் 1 mM செறிவு கொண்டது.C இல், மேல், Coomassie படிந்த nsp9-His6 காட்டப்பட்டுள்ளது, மேலும் C, கீழே, தொடர்புடைய ஆட்டோரேடியோகிராபி காட்டப்பட்டுள்ளது.லேபிளிடப்பட்ட புரதத்தின் அளவு (கிலோடால்டன்களில்) A மற்றும் C க்கு இடதுபுறத்தில் காட்டப்பட்டுள்ளது. (D) HCoV-229E nsp12-His6 இன் பிறழ்ந்த வடிவம் குறிப்பிடப்பட்ட அமினோ அமில மாற்றீட்டைச் சுமந்து [α-32P]UTP இல் உள்ளது. பொருட்கள் மற்றும் முறைகளில்.NMPylation எதிர்வினையில் உற்பத்தி செய்யப்படும் ரேடியோலேபிள் செய்யப்பட்ட nsp9-His6 பாஸ்போரிலேஷன் இமேஜிங் (D, மேல்) மூலம் கண்டறியப்படுகிறது.காட்டு-வகை (wt) புரதத்துடன் ஒப்பிடும்போது தொடர்புடைய செயல்பாடு D இல் காட்டப்பட்டுள்ளது, மேலும் கீழே மூன்று சுயாதீன சோதனைகளிலிருந்து சராசரியாக (±SEM) எடுக்கப்படுகிறது.நட்சத்திரக் குறியீடுகள் பாதுகாக்கப்படாத எச்சங்களின் மாற்றீடுகளைக் குறிக்கின்றன.(இ) தொற்று ஏற்பட்ட 24 மணி நேரத்திற்குப் பிறகு பெறப்பட்ட p1 கலங்களின் கலாச்சார சூப்பர்நேட்டண்டில் உள்ள வைரஸ் டைட்டர் பிளேக் மதிப்பீட்டால் தீர்மானிக்கப்பட்டது.பொறிக்கப்பட்ட HCoV-229E விகாரியின் NiRAN டொமைனில் உள்ள கோடான் மாற்றீடுகள் குறிப்பிடப்படுகின்றன (எச்ச எண்கள் pp1ab இல் அவற்றின் நிலையை அடிப்படையாகக் கொண்டது).பிரதி-குறைபாடுள்ள RdRp செயலில் உள்ள தளம் பிறழ்ந்த nsp12_DD4823/4AA ஒரு கட்டுப்பாட்டாகப் பயன்படுத்தப்பட்டது.

NiRAN இன் செயலில் உள்ள தளத்தைப் பற்றிய ஆழமான புரிதலைப் பெறவும், nsp9-குறிப்பிட்ட NMP பரிமாற்றத்தின் செயல்பாடு தொடர்பான எச்சங்களைத் தீர்மானிக்கவும், நாங்கள் பிறழ்வு பகுப்பாய்வு செய்தோம், இதில் NiRAN AN, BN மற்றும் CN மையக்கருத்துகளில் உள்ள பழமைவாத எச்சங்களை மாற்றினோம் ( 16) இது ஆலா (SI பின்னிணைப்பு, படம் S2).கூடுதலாக, பழமைவாத Arg-to-Lys அல்லது Lys-to-Arg மாற்றீடுகளின் தாக்கம் இரண்டு நிகழ்வுகளில் மதிப்பிடப்பட்டது.(எதிர்மறை) கட்டுப்பாட்டாக, கொரோனா வைரஸ்கள் மற்றும் பிற உள்ளமை வைரஸ்களின் NiRAN டொமைனில் பாதுகாக்கப்படாத அல்லது குறைவாக இருக்கும் எச்சங்கள் Ala உடன் மாற்றப்படுகின்றன. BN) மற்றும் D4280A (CN) nsp12 மூலம் nsp9 NMPylation ஐக் கணிசமாகக் குறைக்கிறது அல்லது நீக்குகிறது, அதே சமயம் பழமைவாத மாற்றீடுகள் (R4178K) , K4116R) கொண்ட புரதங்கள் 60% மற்றும் 80% செயல்பாட்டைத் தக்கவைத்துக்கொள்கின்றன, இது அந்தந்தப் பக்கத்தில் கட்டுப்பாடுகள் தளர்த்தப்படுவதைக் குறிக்கிறது. சங்கிலிகள் இயற்பியல் வேதியியல் ரீதியாக உணர்திறன் கொண்டவை (படம் 3D).பல பாதுகாக்கப்பட்ட எச்சங்கள் E4145A, D4273A, F4281A மற்றும் D4283A ஆகியவற்றை மாற்றுவது மிகவும் குறைவான தீங்கு விளைவிக்கும், மேலும் nsp9 UMPylation மிதமான அளவில் மட்டுமே குறைக்கப்படுகிறது.இதே போன்ற முடிவுகள், மற்ற NTPகள் (படம் 3D மற்றும் SI பின்னிணைப்பு, படம் S3) சம்பந்தப்பட்ட nsp9 NMPylation எதிர்வினைகளில் பெறப்பட்டன, இது குறிப்பிட்ட அமினோ அமில மாற்றீடுகளில் கவனிக்கப்பட்ட விளைவுகள் நியூக்ளியோடைடு இணை-அடி மூலக்கூறு வகையைச் சார்ந்தது அல்ல என்பதை உறுதிப்படுத்துகிறது.அடுத்து, செல் கலாச்சாரத்தில் கொரோனா வைரஸ்களின் நகலெடுப்பதில் இந்த nsp12 மாற்றீடுகளின் சாத்தியமான தாக்கத்தை நாங்கள் சோதித்தோம்.இந்த நோக்கத்திற்காக, 5 -7 செல்களை டிரான்ஸ்கிரிப்ட் செய்ய மறுசீரமைப்பு தடுப்பூசி வைரஸ் (23, 24) இல் குளோன் செய்யப்பட்ட பொருத்தமான மரபணு பொறியியல் நிரப்பு டிஎன்ஏ (சிடிஎன்ஏ) டெம்ப்ளேட்களைப் பயன்படுத்தினோம்.இந்த உயிரணுக்களில் உற்பத்தி செய்யப்படும் தொற்று வைரஸ் சந்ததிகளின் டைட்ரேஷன் பெரும்பாலான HCoV-229E NiRAN மரபுபிறழ்ந்தவர்கள் சாத்தியமில்லை என்பதைக் காட்டுகிறது (படம் 3E).சாத்தியமற்ற வைரஸ் மரபுபிறழ்ந்தவர்களின் குழுவில், விட்ரோவில் (K4116A, K4135A, R4178A, D4188A, D4280A, D4283A) NMP பரிமாற்றச் செயல்பாட்டை அகற்ற அல்லது கணிசமாகக் குறைக்கும் மாற்று வழிகள் உள்ளன, ஆனால் வேறு இரண்டு மாற்றுகள் உள்ளன (K4116R, E41045A) % ஒதுக்கப்பட்டதா?அவர்களின் இன் விட்ரோ NMPylation செயல்பாடு கூடுதல் கட்டுப்பாடுகள் சம்பந்தப்பட்டிருப்பதாகக் கூறுகிறது.இதேபோல், மற்ற இரண்டு பிறழ்வுகள் (R4178K, F4281A) NiRAN இன் இன் விட்ரோ NMPylation செயல்பாட்டில் மிதமான குறைவை ஏற்படுத்தியது, நேரடி வைரஸ்களை உருவாக்கியது, இருப்பினும், இந்த வைரஸ்கள் பிரதியெடுப்பு மூலம் டைட்டர்களை கணிசமாகக் குறைத்தன.படம் 3D இல் காட்டப்பட்டுள்ள இன் விட்ரோ செயல்பாட்டுத் தரவுக்கு இணங்க, கொரோனா வைரஸ் மற்றும்/அல்லது பிற உள்ளமை வைரஸ்களில் (K4113A, D4180A, D4197A, D4273A) (8, 16) பாதுகாக்கப்படாத மற்ற நான்கு எச்சங்களை மாற்றுவது (8, 16) சாத்தியமான வைரஸ்களை உருவாக்கியது. காட்டு-வகை வைரஸுடன் ஒப்பிடும்போது ஒரு மிதமான குறைக்கப்பட்ட டைட்டர் (படம் 3E).

NiRAN-மத்தியஸ்த NMP பரிமாற்றச் செயல்பாடு செயலில் உள்ள RdRp டொமைனைச் சார்ந்ததா என்பதை ஆய்வு செய்வதற்காக, RdRp மையக்கருத்து C இல் உள்ள divalent உலோக அயனிகளின் (11) ஒருங்கிணைப்பில் ஈடுபட்டுள்ள இரண்டு பாதுகாக்கப்பட்ட Asp எச்சங்கள் Ala ஆல் மாற்றப்பட்டன. இதன் விளைவாக nsp12_DD4823/4AA புரதம் உள்ளது. அதன் nsp9 NMPylation செயல்பாடு, nsp12-மெடியேட்டட் இன் விட்ரோ nsp9 NMPylation செயல்பாட்டிற்கு பாலிமரேஸ் செயல்பாடு தேவையில்லை என்பதைக் குறிக்கிறது (SI பின் இணைப்பு, படம் S4).

nsp12 க்கான nsp9-குறிப்பிட்ட NMP பரிமாற்ற செயல்பாட்டை நிறுவிய பிறகு, NMP-nsp9 சேர்க்கையை மாஸ் ஸ்பெக்ட்ரோமெட்ரி (MS) மூலம் வகைப்படுத்த முயற்சித்தோம்.மறுசீரமைப்பு HCoV-229E nsp9 இன் முழுமையான புரத நிறை ஸ்பெக்ட்ரம் 12,045 Da இல் உச்சத்தைக் காட்டியது (படம் 4A).nsp12 ஐச் சேர்ப்பது nsp9 இன் தரத்தை மாற்றவில்லை, இது nsp12 மற்றும் nsp9 ஆகியவை பயன்படுத்தப்படும் நிபந்தனைகளின் கீழ் நிலையான வளாகத்தை உருவாக்காது என்பதைக் குறிக்கிறது (படம் 4A).UTP மற்றும் GTP முன்னிலையில், nsp9 மற்றும் nsp12 கொண்ட வினையின் நிறை அளவீடு முறையே UTP இன் புரத நிறை 306 Da ஐ நகர்த்தியது, மற்றும் GTP இன் புரத நிறை 345 Da நகர்ந்தது, இது ஒவ்வொரு nsp9 மூலக்கூறும் ஒரு UMP அல்லது GMP ஐ பிணைக்கிறது என்பதைக் குறிக்கிறது. (படம் 4) சி மற்றும் டி).NiRAN-மத்தியஸ்த nsp9 NMPylation க்கு தேவையான ஆற்றல் NTP நீராற்பகுப்பு மற்றும் பைரோபாஸ்பேட் வெளியீட்டில் இருந்து வருகிறது என்று ஊகிக்கப்படுகிறது.இந்த எதிர்வினையில் nsp12 (என்சைம்) ஐ விட nsp9 (இலக்கு) 10 மடங்கு மோலார் அதிகமாகப் பயன்படுத்தப்பட்டாலும், nsp9 இன் கிட்டத்தட்ட முழுமையான NMPylation காணப்பட்டது, nsp12 மற்றும் nsp9 ஆகியவற்றுக்கு இடையேயான தொடர்பு குறுகிய காலமே இருப்பதைக் குறிக்கிறது, மேலும் nsp12 அதிக nsp9 ஐ NMPylate செய்ய முடியும். இன் விட்ரோ மூலக்கூறு.

nsp12 மற்றும் UTP அல்லது GTP முன்னிலையில் nsp9 இன் ஒற்றை NMPylation.HCoV-229E nsp9 (SI பின்னிணைப்பு, அட்டவணை S1) (AD) இன் சிதைந்த முழுமையான புரத நிறை ஸ்பெக்ட்ரம் காட்டப்பட்டுள்ளது.(A) nsp9 மட்டும், (B) nsp9 + nsp12-His6, (C) nsp9 + nsp12-His6 UTP முன்னிலையில், (D) nsp9 + nsp12-His6 GTP முன்னிலையில்.

nsp12 ஆல் UMPylated nsp9 எச்சங்களைத் தீர்மானிக்க, nsp9-UMP டிரிப்சினுடன் பிளவுபடுத்தப்பட்டது.இதன் விளைவாக வரும் பெப்டைடுகள் நானோ-உயர் செயல்திறன் திரவ நிறமூர்த்தம் (HPLC) மூலம் பிரிக்கப்பட்டு ஆன்லைனில் டேன்டெம் மாஸ் ஸ்பெக்ட்ரோமெட்ரி (MS/MS) மூலம் பகுப்பாய்வு செய்யப்பட்டது.பியோனிக் மென்பொருள் தொகுப்பைப் பயன்படுத்தி தரவு பகுப்பாய்வு (புரோட்டீன் மெட்ரிக்ஸ்) என்-டெர்மினல் அமினோ அமிலத்தின் UMPylation ஐக் காட்டியது.இது கைமுறையாக உறுதிப்படுத்தப்படுகிறது.முன்னோடி பெப்டைட் [UMP]NNEIMPGK இன் டேன்டெம் மாஸ் ஸ்பெக்ட்ரம் (SI பின்னிணைப்பு, படம் S5A) 421 m/z இல் ஒரு பகுதியை வெளிப்படுத்தியது, UMP nsp9 இன் எச்சம் 1 உடன் பிணைக்கிறது என்பதைக் குறிக்கிறது.

nsp9 இன் N-டெர்மினஸில், Orthocoronavirinae உறுப்பினர்களிடையே Asn பாதுகாக்கப்படுகிறது (SI பின்னிணைப்பு, படம் S6).N-டெர்மினல் ப்ரைமரி அமீன் நைட்ரஜன் UMP க்கு ஏற்றது என்று நாங்கள் நம்பினாலும், N-முனையத்தில் NMP பிணைப்புக்கான கூடுதல் ஆதாரங்களைப் பெற முடிவு செய்தோம்.இந்த காரணத்திற்காக, HPLC ஆல் சுத்திகரிக்கப்பட்ட NMPylated மற்றும் NMPylated N-terminal peptide nsp9 ஆனது அசிட்டோன் மற்றும் சோடியம் சயனோபோரோஹைட்ரைடு முன்னிலையில் பெறப்பட்டது.இந்த நிலைமைகளின் கீழ், இலவச முதன்மை அமின்களை மட்டுமே ப்ரோபில் (25) மூலம் மாற்றியமைக்க முடியும்.NNEIMPGK வரிசையுடன் கூடிய N-டெர்மினல் nsp9-பெறப்பட்ட பெப்டைடில் இரண்டு முதன்மை அமின்கள் உள்ளன, ஒன்று Asn இன் N-டெர்மினஸிலும் மற்றொன்று C-டெர்மினஸில் உள்ள Lys இன் பக்கச் சங்கிலியிலும் உள்ளது.எனவே, இரு முனைகளிலும் ப்ரோபில் குழுக்களை அறிமுகப்படுத்தலாம்.NMPylated அல்லாத பெப்டைட்களின் பிரித்தெடுக்கப்பட்ட அயன் குரோமடோகிராம்கள் SI பின் இணைப்பு, படம் S5B இல் காட்டப்பட்டுள்ளன.எதிர்பார்த்தபடி, என்-டெர்மினல் மற்றும் சி-டெர்மினல் (மோனோ) புரோபிலேட்டட் (SI பின்னிணைப்பு, படம் S5B, மேல் பாதை) மற்றும் டிப்ரோபிலேட்டட் பெப்டைடுகள் (SI பின்னிணைப்பு, படம் S5B, கீழ் பாதை) ஆகியவற்றை அடையாளம் காணலாம்.nsp9 இன் NMPylated N-terminal peptideஐப் பயன்படுத்துவதன் மூலம் இந்த முறை மாறுகிறது.இந்த வழக்கில், சி-டெர்மினல் புரோபிலேட்டட் பெப்டைட்களை மட்டுமே அடையாளம் காண முடியும், ஆனால் என்-டெர்மினல் புரோபிலேட்டட் பெப்டைடுகள் மற்றும் டிப்ரோபிலேட்டட் பெப்டைடுகள் அடையாளம் காணப்படவில்லை (SI பின்னிணைப்பு, படம் S5C), இதைத் தடுக்க UMP ஆனது N-டெர்மினல் ப்ரைமரி அமினுக்கு மாற்றப்பட்டுள்ளது என்பதைக் குறிக்கிறது. மாற்றங்களைச் செய்வதிலிருந்து குழு.

அடுத்து, இலக்கு-குறிப்பிட்ட தடைகளை வரையறுக்க nsp9 இன் N-டெர்மினஸில் (Ala அல்லது Ser உடன்) மாற்றுவோம் அல்லது பாதுகாக்கப்பட்ட எச்சங்களை நீக்குவோம்.nsp9 இன் N-டெர்மினல் எச்சத்தின் முதன்மை அமினுடன் NiRAN ஒரு nsp9-NMP சேர்க்கையை உருவாக்குகிறது என்பதைக் காட்டும் எங்கள் MS தரவுகளின் அடிப்படையில், nsp9 NMPylation க்கு nsp9 N- முனையத்தை வெளியிட வைரஸ் மாஸ்டர் புரோட்டீஸ் (Mpro, nsp5) தேவை என்று நாங்கள் கருதுகிறோம். அதன் பாலிபுரோட்டீன் முன்னோடி.இந்தக் கருதுகோளைச் சோதிக்க, E. coli இல் nsp9 கொண்ட முன்னோடி புரதம் nsp7-11 ஐத் தயாரித்தோம் மற்றும் [α-32P] UTP (பொருட்கள் மற்றும் முறைகள்) முன்னிலையில் நிலையான NMPylation சோதனையைச் செய்தோம்.படம் 5A (லேன் 3) இல் காட்டப்பட்டுள்ளபடி, வெட்டப்படாத nsp7-11 முன்னோடி nsp12 உடன் ரேடியோலேபிள் செய்யப்படவில்லை.இதற்கு நேர்மாறாக, முன்னோடியிலிருந்து nsp9 (மற்றும் பிற nsps) ஐ வெளியிட nsp7-11 மறுசீரமைப்பு nsp5 ஆல் பிளவுபடுத்தப்பட்டால், nsp9 உடன் இடம்பெயரும் ஒரு ரேடியோலேபிளிடப்பட்ட புரதம் கண்டறியப்பட்டது, இது NiRAN மற்றும் N- கோவலன்ட் nsp9-NMP சேர்க்கைகளின் தேர்ந்தெடுக்கப்பட்ட உருவாக்கம் என்ற எங்கள் முடிவை உறுதிப்படுத்துகிறது. .N-டெர்மினல் Asn இன் முனைய முதன்மை அமீன் (pp1a/pp1ab இல் நிலை 3825).N-டெர்மினஸில் ஒன்று அல்லது இரண்டு கூடுதல் எச்சங்களைக் கொண்டிருக்கும் nsp9 கன்ஸ்ட்ரக்டைப் பயன்படுத்தும் சோதனைகளாலும் இந்த முடிவு ஆதரிக்கப்படுகிறது.இரண்டு சந்தர்ப்பங்களிலும், nsp9 இன் NiRAN-மத்தியஸ்த UMPylation ரத்து செய்யப்பட்டது (SI பின் இணைப்பு, படம் S7).அடுத்து, nsp9 இன் N-டெர்மினலில் 3825-NNEIMPK-3832 பெப்டைட் வரிசையிலிருந்து நீக்கப்பட்ட ஒன்று அல்லது இரண்டு Asn எச்சங்களைக் கொண்ட ஒரு புரதத்தை உருவாக்கினோம்.இரண்டு நிகழ்வுகளிலும், nsp9 UMPylation முற்றிலும் தடுக்கப்பட்டது (படம் 5B), உண்மையான nsp9 N-டெர்மினஸ் NMP ஏற்பியாக செயல்படுகிறது என்பதற்கான கூடுதல் ஆதாரத்தை வழங்குகிறது.

nsp9 இன் புரோட்டியோலிடிக் செயலாக்கம் மற்றும் nsp12-மத்தியஸ்த UMPylation இல் N-முனைய எச்சங்களின் பங்கு.(A) nsp9 UMPylationக்கு இலவச nsp9 N-டெர்மினல் தேவை.Nsp7-11-His6 30 °C வெப்பநிலையில் NMPylation கண்டறிதல் பஃப்பரில் UTPயை மறுசீரமைப்பு Mpro (nsp5-His6) முன்னிலையில் அல்லது இல்லாமையில் உள்ளது.3 மணிநேரத்திற்குப் பிறகு, பொருட்கள் மற்றும் முறைகளில் விவரிக்கப்பட்டுள்ளபடி nsp12-His6 ஐச் சேர்ப்பதன் மூலம் NMPylation மதிப்பீட்டைத் தொடங்கவும்.nsp5-His6 (லேன் 1) மற்றும் nsp9-His6 (லேன் 2) ஆகியவற்றைக் கொண்ட எதிர்வினை ஒரு கட்டுப்பாட்டாகப் பயன்படுத்தப்பட்டது.10 நிமிடங்களுக்குப் பிறகு, எதிர்வினை நிறுத்தப்பட்டது மற்றும் எதிர்வினை கலவை SDS-PAGE மூலம் பிரிக்கப்பட்டது.புரதமானது Coomassie Brilliant Blue (A, top) உடன் படிந்திருந்தது.Nsp7-11-His6 முன்னோடி மற்றும் nsp5-His6 மத்தியஸ்த பிளவு விளைவாக செயலாக்கப்பட்ட தயாரிப்பு வலதுபுறத்தில் காட்டப்பட்டுள்ளது.இந்த ஜெல்லில் nsp7 மற்றும் nsp11-His6 கண்டறியப்படவில்லை என்பதை (அவற்றின் சிறிய அளவு காரணமாக) நினைவில் கொள்ளவும், மேலும் எதிர்வினை nsp5-His6 உடன் கூடுதலாக உள்ளது (பாதைகள் 1 மற்றும் 4; nsp5-His6 இன் நிலை திட வட்டத்தால் குறிக்கப்படுகிறது) அல்லது nsp9-His6 (Lane 2) ஒரு சிறிய அளவு MBP (திறந்த வட்டங்களால் குறிக்கப்படுகிறது) எஞ்சிய அசுத்தங்களைக் கொண்டுள்ளது, ஏனெனில் அவை MBP இணைவு புரதங்களாக வெளிப்படுத்தப்படுகின்றன (SI பின்னிணைப்பு, அட்டவணை S1).(B) Nsp9-His6 மாறுபாட்டில் ஒன்று அல்லது இரண்டு N-டெர்மினல் Asn எச்சங்கள் இல்லை (pp1a/pp1ab இல் உள்ள நிலைக்கு ஏற்ப எச்ச எண்கள்) மற்றும் nsp12-His6 மற்றும் [α-32P] UTP உடன் சுத்திகரிக்கப்பட்டு அடைகாக்கப்படுகிறது.B, Coomassie உடன் படிந்த SDS-PAGE மேலே காட்டப்பட்டுள்ளது, B, தொடர்புடைய ஆட்டோரேடியோகிராஃப் கீழே காட்டப்பட்டுள்ளது.மூலக்கூறு எடை மார்க்கரின் நிலை (கிலோடால்டன்களில்) இடதுபுறத்தில் காட்டப்பட்டுள்ளது.(C) HCoV-229E nsp9-His6 N-டெர்மினல் பாதுகாக்கப்பட்ட எச்சங்கள் Ala அல்லது Ser உடன் மாற்றப்பட்டன, மேலும் nsp12-His6 மத்தியஸ்த UMPylation எதிர்வினையிலும் அதே அளவு புரதம் பயன்படுத்தப்பட்டது.எதிர்வினை தயாரிப்புகள் SDS-PAGE ஆல் பிரிக்கப்பட்டு Coomassie Brilliant Blue (C, top) உடன் கறை படிந்தன, மேலும் ரேடியோலேபிள் செய்யப்பட்ட nsp9-His6 ஆனது பாஸ்போரெசென்ஸ் இமேஜிங் (C, நடுத்தர) மூலம் கண்டறியப்பட்டது.காட்டு-வகை (wt) புரதத்தை ஒரு குறிப்பு (100% என அமைக்கப்பட்டது) பயன்படுத்தி, தொடர்புடைய NMPylation செயல்பாடு (சராசரி ± SEM) மூன்று சுயாதீன சோதனைகளிலிருந்து கணக்கிடப்பட்டது.(D) HCoV-229E காட்டு-வகை Huh-7 செல்களால் பாதிக்கப்பட்ட Huh-7 செல்களின் p1 செல் கலாச்சார சூப்பர்நேட்டண்டில் உள்ள வைரஸ் டைட்டர்கள் மற்றும் nsp9 இல் நியமிக்கப்பட்ட அமினோ அமில மாற்றீடுகளைக் கொண்ட மரபுபிறழ்ந்தவர்கள் பிளேக் மதிப்பீட்டின் மூலம் தீர்மானிக்கப்பட்டது.பிரதி-குறைபாடுள்ள RdRp மையக்கருத்து C இரட்டை பிறழ்ந்த DD4823/4AA எதிர்மறைக் கட்டுப்பாட்டாகப் பயன்படுத்தப்பட்டது.

nsp9 இன் N-டெர்மினஸ் (குறிப்பாக 1, 2, 3 மற்றும் 6 நிலைகள்) ஆர்த்தோகொரோனாவிரினே துணைக் குடும்பத்தின் உறுப்பினர்களிடையே மிகவும் பாதுகாக்கப்படுகிறது (SI பின்னிணைப்பு, படம் S6).nsp12-மத்தியஸ்த nsp9 NMPylation இல் இந்த எச்சங்களின் சாத்தியமான பங்கைப் படிப்பதற்காக, nsp9 இன் N-டெர்மினஸில் இரண்டு தொடர்ச்சியான Asn எச்சங்கள் Ala அல்லது Ser (தனியாக அல்லது இணைந்து) மாற்றப்பட்டன.காட்டு-வகை nsp9 உடன் ஒப்பிடும்போது, ​​N3825 ஐ Ala அல்லது Ser உடன் மாற்றுவதன் விளைவாக nsp12-மத்தியஸ்த UMPylation (படம் 5C) இரண்டு மடங்குக்கு மேல் குறைக்கப்பட்டது.N-டெர்மினல் எச்சத்தின் பக்கச் சங்கிலிக்குப் பதிலாக N-முனைய முதன்மை அமினில் NMPylation நிகழ்கிறது என்ற எங்கள் முடிவுக்கு இணங்க, N3825A மற்றும் N3825S ஐ மாற்றுவதன் மூலம் குறிப்பிடத்தக்க எஞ்சிய NMPylation ஐக் கவனித்தோம்.சுவாரஸ்யமாக, இரண்டாவது Asn ஐ Ala அல்லது Ser ஆல் மாற்றினால், nsp9 UMPylation மிகவும் வலுவாக (10 மடங்குக்கு மேல்) குறைக்கப்படுகிறது, அதே நேரத்தில் 3, 4 மற்றும் 6 நிலைகளில் Ala ஐ மாற்றுவது nsp9 UMPylation இல் மிதமான விளைவை மட்டுமே கொண்டுள்ளது (படம் 2 ) .5C).ATP, CTP அல்லது GTP (SI பின்னிணைப்பு, படம் S8) ஆகியவற்றைப் பயன்படுத்தி இதே போன்ற முடிவுகள் பெறப்பட்டன.ஒட்டுமொத்தமாக, இந்தத் தரவுகள் nsp9 NMPylation இல் N2826 (nsp9 இல் நிலை 2) இன் முக்கியப் பங்கைக் குறிப்பிடுகின்றன.

nsp9 மற்றும் NMPylation ஆகியவற்றின் N-டெர்மினஸுக்கு இடையேயான செயல்பாட்டு தொடர்புக்கான கூடுதல் ஆதாரங்களைப் பெறுவதற்காக, கொரோனா வைரஸ் குடும்பத்தின் (104 மற்றும் 113 எச்சங்களுக்கு இடையில் மாறுபடும்) nsp9 வரிசையின் பல வரிசை சீரமைப்பை (MSA) செய்தோம் (SI பின் இணைப்பு, படம் S6).மொத்தத்தில், வெவ்வேறு பாலூட்டிகள், பறவைகள் மற்றும் ஊர்வன புரவலன்களைப் பாதிக்கும் Orthocoronavirinae துணைக் குடும்பத்தின் 5 வகைகளின் 47 (அறியப்பட்ட மற்றும் தூண்டக்கூடிய) இனங்களில், மொத்தம் 8 எச்சங்கள் மட்டுமே மாறாதவையாகக் கண்டறியப்பட்டன.முந்தைய கட்டமைப்பு ஆய்வுகள் (26 ??28) தீர்மானித்தபடி, nsp9 இன் இரண்டாம் கட்டமைப்பு கூறுகளுக்கு இடையே உள்ள சுழற்சிகளில் நீக்குதல் மற்றும் செருகல்கள் உட்பட மிகவும் விரிவான மாற்றங்கள் காணப்பட்டன.nsp9 இன் சி-டெர்மினல் பகுதியின் β இழை மற்றும் α ஹெலிக்ஸ் ஆகியவற்றில் ஐந்து மாறாத எச்சங்கள் காணப்பட்டன.மூன்று மாறாத எச்சங்கள் nsp9 இன் N டெர்மினஸின் NNE மையக்கருத்தை உருவாக்குகின்றன.இந்த மையக்கருத்தின் இரண்டாவது அஸ்ன் மட்டுமே மாறாத எச்சம் என்பது தெரியவந்துள்ளது, இது தொலைதூர தொடர்புடைய தவளை கொரோனா வைரஸின் அனுமான nsp9 ஆல் பகிரப்படுகிறது, மேலும் இது அல்பலெட்டோவைரஸின் துணைக் குடும்பமான லெட்டோவிரினேயில் உள்ள மைக்ரோஹைலா லெட்டோவைரஸ் 1 இனத்தைக் குறிக்கிறது.nsp9 இரண்டாம் நிலை கட்டமைப்பு கூறுகளில் உள்ள எச்சங்களின் பாதுகாப்பு மடிப்பு அல்லது அறியப்பட்ட RNA பிணைப்பு பண்புகளை பராமரிக்க கட்டமைப்பு பரிசீலனைகள் மூலம் பகுத்தறிவு செய்யப்படலாம்.எவ்வாறாயினும், இந்த பகுத்தறிவு NNE இன் பாதுகாப்பிற்கு பொருந்துவதாகத் தெரியவில்லை, மேலும் இந்த ஆய்வுக்கு முன்னர், டிரிப்டைட் வரிசையின் மாறுபாட்டைக் கட்டுப்படுத்தும் கட்டுப்பாடுகளின் தன்மை முற்றிலும் மறைக்கப்பட்டது.

கொரோனா வைரஸ் பிரதியெடுப்பில் nsp9-NMPylation மற்றும் NNE பாதுகாப்பின் முக்கியத்துவத்தை தீர்மானிக்க, நாங்கள் HCoV-229E மரபுபிறழ்ந்தவர்களை உருவாக்கினோம், அவை nsp9 N-டெர்மினல் எச்சங்களின் ஒற்றை அல்லது இரட்டை மாற்றீடுகளைக் கொண்டுள்ளன, இது விட்ரோவில் nsp9 NMPylation தீங்கு விளைவிக்கும் என்பதைக் குறிக்கிறது.நாங்கள் தொடங்குவதற்கு முன், இந்த மாற்றீடுகள் (nsp8|9 பிளவு தளத்திற்கு அருகில்) C-டெர்மினல் pp1a பகுதியின் புரோட்டியோலிடிக் செயலாக்கத்தை பாதிக்குமா என்ற கேள்விக்கு பதிலளிக்க முயற்சிக்கிறோம்.nsp9 இன் N-டெர்மினஸில் தொடர்புடைய மாற்றீடுகளைக் கொண்ட nsp7-11 பாலிபுரோட்டீன் கட்டுமானங்களின் தொகுப்பு E. coli இல் தயாரிக்கப்பட்டு மறுசீரமைப்பு Mpro உடன் வெட்டப்பட்டது.நான்கு தளங்களின் புரோட்டியோலிடிக் பிளவு (என்எஸ்பி9 பக்கவாட்டு தளம் உட்பட) அறிமுகப்படுத்தப்பட்ட மாற்றீடுகளால் (SI பின்னிணைப்பு, படம் S9) குறிப்பிடத்தக்க அளவில் பாதிக்கப்படவில்லை, இந்த புரதங்களின் கட்டமைப்பு மாற்றங்கள் தவிர, Mpro-மத்தியஸ்த nsp8|9 பிளவு (அல்லது மற்றவை) இணையதளம்.

Huh-7 செல்கள் மரபணு-நீள HCoV-229E RNA உடன் மாற்றப்பட்டு, nsp9 N டெர்மினஸில் பாதுகாக்கப்பட்ட NNE ட்ரிப்டைட்களில் (N3825, N3826, மற்றும் E3827) ஆலா அல்லது செர் மாற்றீடுகளை குறியாக்கம் செய்து, பெரும்பாலான பிறழ்வுகள் ஆபத்தானவை என்பதைக் காட்டுகிறது.N-டெர்மினல் Asn (N2835A அல்லது N2835S) இன் Ser அல்லது Ala ஐ மாற்றுவதன் மூலம் எங்களால் வைரஸைக் காப்பாற்ற முடிந்தது, ஆனால் NNE வரிசையில் (N3826A, N3826S, NN3825/6AA, மற்ற ஒற்றை மற்றும் இரட்டை பிறழ்வுகள் மூலம் வைரஸை மீட்டெடுக்க முடியவில்லை. NN3825/6SS) , E3827A) (படம் 5D).

இந்த முடிவுகள் திசு வளர்ப்பில் கொரோனா வைரஸ்களின் பிரதிபலிப்பு தடைசெய்யப்பட்டுள்ளது (அதே அல்லது ஒத்த), உடலில் உள்ள nsp9 NMPylation தளங்களின் இயற்கையான பிறழ்வைக் கட்டுப்படுத்துகிறது மற்றும் கொரோனா வைரஸ்களின் வாழ்க்கைச் சுழற்சியில் இந்த பதிலின் முக்கிய பங்கை ஆதரிக்கிறது.

சோதனைகளின் கடைசித் தொகுப்பில், SARS-CoV-2 nsp12 மற்றும் nsp9 என்று பெயரிடப்பட்ட C-டெர்மினல் His6 ஐயும், E. coli இல் nsp12 இன் இரண்டு பிறழ்ந்த வடிவங்களையும் உருவாக்கினோம்.NiRAN மற்றும் RdRp களங்களில் செயலில் உள்ள தள எச்சங்கள் முறையே Ala ஐப் பயன்படுத்துகின்றன (படம் 6A மற்றும் SI பின்னிணைப்பு, அட்டவணை S2).SARS-CoV-2 nsp12 இல் உள்ள K4465 ஆனது HCoV-229E இல் உள்ள K4135 ஐ ஒத்துள்ளது (SI இணைப்பு, படம் S2), இது NiRAN செயல்பாடு மற்றும் HCoV-229E நகலெடுப்பிற்குத் தேவை என்று நிரூபிக்கப்பட்டது (படம் 3D மற்றும் E).இந்த எச்சம் தமனி வைரஸ் EAV nsp9 K94 எச்சத்துடன் ஒத்துப்போகிறது, இது NiRAN சுய-UMPylation/self-GMPylation (16) க்கு அவசியம் என்று முன்பு காட்டப்பட்டது.படம் 6B இல் காட்டப்பட்டுள்ளபடி, SARS-CoV-2 nsp12 ஆனது nsp9 ஐ அடி மூலக்கூறாகப் பயன்படுத்தி UMP பரிமாற்றச் செயல்பாட்டைக் கொண்டுள்ளது, அதே சமயம் nsp12_K4465A செயலில் உள்ள தளம் விகாரமானது செயலற்ற நிலையில் உள்ளது.RdRp motif C இன் SDD சிறப்பியல்பு வரிசையில் இரட்டை மாற்றீடு UMP பரிமாற்ற செயல்பாட்டை பாதிக்காது (படம் 6B), RdRp செயல்பாடு nsp9 UMPylation இல் நேரடி விளைவைக் கொண்டிருக்கவில்லை என்பதைக் குறிக்கிறது.CTP, GTP மற்றும் ATP (SI பின்னிணைப்பு, படம் S10) ஆகியவற்றைப் பயன்படுத்தி இதே போன்ற தரவு பெறப்பட்டது.சுருக்கமாக, இந்த தரவு NiRAN-மத்தியஸ்தம் nsp9 NMPylation ஆர்த்தோகொரோனாவைரஸ் துணைக் குடும்பத்தின் பல்வேறு வகைகளைக் குறிக்கும் கொரோனா வைரஸ்களில் ஒரு பழமைவாத செயல்பாட்டைக் கொண்டுள்ளது என்பதைக் குறிக்கிறது.

SARS-CoV-2 nsp12-மத்தியஸ்தம் nsp9 இன் NMPylation.(A) Coomassie படிந்த SDS-polyacrylamide ஜெல் NMPylation சோதனையில் பயன்படுத்தப்படும் மறுசீரமைப்பு புரதத்தைக் காட்டுகிறது.கட்டுப்பாட்டாக, SARS-CoV-2 nsp12 இன் NiRAN டொமைன் (K4465A) மற்றும் RdRp டொமைன் (DD5152/3AA) ஆகியவற்றில் செயலில் உள்ள தள மாற்றுடன் கூடிய பிறழ்ந்த புரதம் பயன்படுத்தப்பட்டது.எச்ச எண்கள் pp1ab இல் உள்ள நிலையை அடிப்படையாகக் கொண்டது.(B) nsp9-His6 மற்றும் [α-32P]UTP ஐப் பயன்படுத்தி nsp12-His6 (காட்டு வகை [wt] மற்றும் பிறழ்வு) ஆகியவற்றின் அடி மூலக்கூறாக UMPylation கண்டறிதலின் ஆட்டோரேடியோகிராஃப்.பெயரிடப்பட்ட புரதத்தின் மூலக்கூறு நிறை (கிலோடால்டன்களில்) இடதுபுறத்தில் காட்டப்பட்டுள்ளது.

NiRAN டொமைன்கள் பொதுவாக Nidovirales (16) இல் பாதுகாக்கப்படுகின்றன, அவை Nidovirus நகலெடுப்பிற்கு அவசியமான நொதி எதிர்வினைகளை ஊக்குவிக்கின்றன என்பதைக் குறிக்கிறது.இந்த ஆய்வில், கொரோனா வைரஸின் NiRAN டொமைன் NMP ஐ (NTP இலிருந்து உருவாக்கியது) nsp9 க்கு மாற்றுகிறது என்பதை நிரூபிக்க முடிந்தது, இது வைரஸ் பிரதியெடுப்பில் ஈடுபட்டுள்ள மர்மமான RNA பிணைப்பு புரதம் (26 ?? 29 ), இது ஒரு இயற்கை இலக்காக மற்றும் கொரோனா வைரஸ் RTC இன் பங்குதாரர்.

NiRAN டொமைன் மூன்று வரிசை மையக்கருத்துகளை (AN, BN மற்றும் CN) பகிர்ந்து கொள்கிறது, அவை மிகக் குறைந்த எண்ணிக்கையிலான எச்சங்களைக் கொண்டிருக்கின்றன, அவை மோனோபிலெடிக் ஆனால் மிகவும் வேறுபட்ட Nidovirales வரிசையில் (8, 16) அனைத்து குடும்பங்களிலும் பாதுகாக்கப்படுகின்றன.சமீபகால ஆய்வுகள், அவை கட்டமைப்புரீதியாக, புரதம் கைனேஸ் போன்ற புரதங்களின் பெரும்பாலும் வகைப்படுத்தப்படாத குடும்பத்துடன் தொடர்புடையவை என்பதைக் காட்டுகின்றன, அவை முதலில் SelO குடும்பம் (17, 19, 22, 30, 31) என்று அழைக்கப்பட்டன.SelO தொடர்பான புரதங்கள் கைனேஸ் மடிப்புகளைக் கொண்டுள்ளன, ஆனால் கிளாசிக்கல் கைனேஸ்களில் (22, 32) பல பாதுகாக்கப்பட்ட செயலில் உள்ள தள எச்சங்கள் இல்லை.ATP மூலக்கூறுகளின் தலைகீழ் நோக்குநிலையின் அடிப்படையில் செயலில் உள்ள தளத்துடன் பிணைக்கப்பட்டு, குறிப்பிட்ட இடைவினைகளால் நிலைப்படுத்தப்பட்டது, SelO அனுமானிக்கப்பட்டது மற்றும் AMP (பாஸ்பேட்டுக்கு பதிலாக) புரத அடி மூலக்கூறுக்கு (22) மாற்றுவதை உறுதிப்படுத்தியது, அதே நேரத்தில் மற்றொரு பாக்டீரியா SelO போன்ற புரதம் YdiU உள்ளது. டைருடனான UMP இன் கோவலன்ட் இணைப்பு மற்றும் பல்வேறு புரத அடி மூலக்கூறுகளின் எச்சங்கள் (33) ஆகியவற்றை ஊக்குவிப்பதாக சமீபத்தில் காட்டப்பட்டது.

கொரோனா வைரஸ் NiRAN டொமைனின் செயலில் உள்ள தள எச்சங்களின் கணிப்பை உறுதிப்படுத்தவும் விரிவுபடுத்தவும், கொரோனா வைரஸ் nsp12 இல் பிறழ்வு பகுப்பாய்வு செய்ய உயிர்வேதியியல் மற்றும் தலைகீழ் மரபியல் முறைகளைப் பயன்படுத்தினோம் (படம் 3D மற்றும் E மற்றும் SI பின்னிணைப்பு, படம் S3 மற்றும் அட்டவணை) S1â S4).HCoV-229E K4135, R4178 மற்றும் D4280 ஆகியவற்றை ஆலாவுடன் மாற்றுவது, செல் கலாச்சாரத்தில் உள்ள விட்ரோ NMP பரிமாற்ற செயல்பாடு மற்றும் வைரஸ் பிரதிகளை நீக்குகிறது (படம் 3D மற்றும் E மற்றும் SI பின்னிணைப்புகள், படம் S3), NTP γ-பாஸ்பேட்டில் அவற்றின் இருப்பை ஆதரிக்கிறது. (K4135, R4178) மற்றும் செயலில் உள்ள உலோக அயனிகளின் ஒருங்கிணைப்பு (D4280).K4135 (17) நிலையை நிலைநிறுத்தக் கணிக்கப்பட்ட பறவைக் கூடு வைரஸின் வரம்பில் பாதுகாக்கப்பட்ட Glu இன் E4145A மாற்றீடு வைரஸ் நகலெடுப்பை அகற்றுவதாகக் காட்டப்பட்டது, ஆனால் வியக்கத்தக்க வகையில், இன் விட்ரோ NMPylation மதிப்பீட்டில் செயல்பாடு தக்கவைக்கப்பட்டது (படம் 3D மற்றும் E மற்றும் SI பின்னிணைப்பு, படம் S3 மற்றும் அட்டவணைகள் S1-S4).சால்மோனெல்லா டைபிமுரியத்தின் (E130A) (33) YdiU ஹோமோலாக்கில் தொடர்புடைய மாற்றீடு அறிமுகப்படுத்தப்பட்டபோது இதேபோன்ற கவனிப்பு செய்யப்பட்டது.ஒன்றாக எடுத்துக்கொண்டால், இந்தத் தரவு வினையூக்கிச் செயல்பாட்டைக் காட்டிலும் பாதுகாக்கப்பட்ட எச்சத்தின் ஒழுங்குமுறைச் செயல்பாட்டை ஆதரிக்கிறது.

HCoV-229E NiRAN டொமைனில் (8) உள்ள நெஸ்டோவைரஸின் வரம்பிற்குள் பாதுகாக்கப்பட்ட Phe எச்சத்தை (F4281A) மாற்றியதன் விளைவாக விட்ரோவில் NMPylation செயல்பாடு குறைந்து செல் கலாச்சாரத்தில் வைரஸ் நகலெடுப்பதில் குறிப்பிடத்தக்க குறைவு ஏற்பட்டது (படம் 3D, E மற்றும் SI) பின்னிணைப்பு, படம் S3).முன்பு காட்டப்பட்ட ஹோமோலோகஸ் DFG மோட்டிஃப் Phe எச்சம் போன்ற இந்த எச்சத்தின் முக்கியமான ஒழுங்குமுறை செயல்பாட்டுடன் தரவு ஒத்துப்போகிறது.கிளாசிக்கல் புரோட்டீன் கைனேஸ்களில், இது Mg2+ பைண்டிங் லூப்பின் ஒரு பகுதியாகும் மற்றும் முதுகெலும்பை ஒருங்கிணைத்து ஒழுங்குபடுத்த உதவுகிறது???பயனுள்ள வினையூக்கச் செயல்பாட்டிற்குத் தேவை (32, 34).Ala மற்றும் Arg ஐ K4116 எச்சங்களுக்குப் பதிலாக (preAN மையக்கருவில்) முறையே, வைரஸ் பிரதிபலிப்பு நீக்கப்பட்டது மற்றும் எதிர்பார்த்தபடி, அறிமுகப்படுத்தப்பட்ட அமினோ அமில பக்கச் சங்கிலியைப் பொறுத்து, விட்ரோவில் NMP பரிமாற்ற செயல்பாட்டில் வெவ்வேறு விளைவுகளை ஏற்படுத்தியது (படம் 3D மற்றும் E மற்றும் SI பின்னிணைப்புகள் , படம் S3).செயல்பாட்டுத் தரவு கட்டமைப்புத் தகவலுடன் ஒத்துப்போகிறது, இந்த எச்சம் ATP பாஸ்பேட்டுடன் (17) ஒரு தொடர்பை ஏற்படுத்தியிருப்பதைக் குறிக்கிறது.பிற உள்ளமை வைரஸ் குடும்பங்களின் NiRAN டொமைனில், HCoV-229E pp1a/pp1ab K4116 இன் நிலை Lys, Arg அல்லது His (8) ஆல் ஆக்கிரமிக்கப்பட்டுள்ளது, இது இந்த குறிப்பிட்ட எச்சத்தின் செயல்பாட்டுக் கட்டுப்பாடு தளர்த்தப்பட்டதைக் குறிக்கிறது.D4188A மற்றும் D4283A இன் மாற்றீடு நொதிகளின் செயல்பாட்டை நீக்குகிறது அல்லது வலுவாக குறைக்கிறது மற்றும் வைரஸ் நகலெடுப்பை நீக்குகிறது (படம் 3).இந்த இரண்டு எச்சங்களும் பெரும்பாலான (ஆனால் அனைத்துமே இல்லை) உள்ளமை வைரஸ்களில் (8) பாதுகாக்கப்படுகின்றன, இது ஒரு முக்கியமான குடும்பம் சார்ந்த ஆனால் வினையூக்கமற்ற செயல்பாட்டைக் குறிக்கிறது.கொரோனாவிரிடே அல்லது பிற நெஸ்டியோவிரிடே குடும்பங்களில் (8) பாதுகாக்கப்படாத பல Lys மற்றும் Asp எச்சங்களின் (K4113A, D4180A, D4197A மற்றும் D4273A) ஆலா மாற்றீடுகள் கட்டுப்பாடுகளாகப் பயன்படுத்தப்பட்டன.எதிர்பார்த்தபடி, இந்த மாற்றீடுகள் பெரும்பாலும் பொறுத்துக்கொள்ளக்கூடியவை, சில சமயங்களில் நொதி செயல்பாட்டில் சிறிது குறைவு மற்றும் வைரஸ் பிரதிபலிப்பு (படம் 3 மற்றும் SI பின்னிணைப்பு, படம் S3).ஒட்டுமொத்தமாக, கொரோனா வைரஸ் பிறழ்வு தரவு EAV NiRAN-RdRp (16) இன் சுய-GMP மற்றும் தலைகீழ் மரபியல் தரவுகளுடன் மிகவும் ஒத்துப்போகிறது, இதில் EAV nsp9 (கொரோனா வைரஸ் nsp12 ortholog) எச்சம் K94 (HCoV- 229E K4135 உடன் தொடர்புடையது), R124 (R4178 உடன் தொடர்புடையது), D132 (D4188 உடன் தொடர்புடையது), D165 (D4280 உடன் தொடர்புடையது), F166 (F4281 உடன் தொடர்புடையது).கூடுதலாக, HCoV-229E பிறழ்வுத் தரவு, முன்னர் அறிவிக்கப்பட்ட SARS-CoV தலைகீழ் மரபியல் தரவு (16) இலிருந்து ஒத்துப்போகிறது மற்றும் விரிவாக்கப்பட்டது, இது தொடர்புடைய CN மையக்கருத்து Phe-to-Ala விகாரி SARS-CoV_nsp12 தி. பினோடைப் விவரிக்கப்பட்டது -F219A மற்றும் HCoV-229E_F4281A (படம் 3 D மற்றும் E மற்றும் SI பின்னிணைப்பு, படம் S3 மற்றும் அட்டவணை S1-S4).

EAV orthologs (16) உடன் ஒப்பிடும்போது, ​​UTP மற்றும் GTP க்கு (சுய-NMPylation எதிர்வினையில்) தெளிவான விருப்பம் உள்ளது, எங்கள் ஆய்வு கொரோனா வைரஸ் NiRAN டொமைன் (HCoV-229E மற்றும் SARS-CoV-2 ஆல் குறிப்பிடப்படுகிறது) திறம்பட செயல்பட முடியும் என்பதைக் காட்டுகிறது. UMP க்கு சிறிது விருப்பம் இருந்தாலும் நான்கு NMPகளையும் மாற்றியது (புள்ளிவிவரங்கள் 1 மற்றும் 3).குறிப்பிட்ட NTP இணை அடி மூலக்கூறின் ஒப்பீட்டளவில் குறைந்த விவரக்குறிப்பு சமீபத்தில் அறிவிக்கப்பட்ட SARS-CoV-2 nsp7/8/12/13 சூப்பர் காம்போசிட் கட்டமைப்புடன் ஒத்துப்போகிறது, இதில் ADP-Mg2+ ஆனது NiRAN இன் செயலில் உள்ள தளத்துடன் பிணைக்கிறது, ஆனால் அடினைன் பகுதியுடன் அல்ல. குறிப்பிட்ட தொடர்புகளின் உருவாக்கம் (17).எங்கள் ஆய்வில், NMPylation எதிர்வினையில் பயன்படுத்தப்படும் நியூக்ளியோடைடு வகை பிறழ்ந்த புரதத்தின் செயல்பாட்டில் வேறுபட்ட விளைவைக் கொண்டிருக்கவில்லை (SI பின்னிணைப்பு, படம் S3), இந்த எச்சங்கள் எதுவும் ஒரு குறிப்பிட்ட நியூக்ளியோபேஸின் பிணைப்புடன் நெருக்கமாக தொடர்புடையவை அல்ல என்பதைக் குறிக்கிறது.கொரோனா வைரஸ்கள் மற்றும் தமனி வைரஸ்களின் NiRAN களங்களில் காணப்பட்ட வெவ்வேறு NTP இணை-அடி மூலக்கூறு விருப்பங்களின் கட்டமைப்பு அடிப்படை மற்றும் சாத்தியமான உயிரியல் முக்கியத்துவம் ஆய்வு செய்யப்பட உள்ளது;அவை உண்மையாக இருக்கலாம் அல்லது அந்தந்த ஆய்வுகளின் வரம்புகள் காரணமாக இருக்கலாம்.தற்போது, ​​தமனி வைரஸ் NiRAN டொமைனின் சாத்தியமான NMPylator செயல்பாடு (முன்பு வகைப்படுத்தப்பட்ட சுய-NMPylation செயல்பாட்டுடன் ஒப்பிடும்போது) வேறுபட்ட இணை-அடி மூலக்கூறு விருப்பம் உள்ளது என்பதை நிராகரிக்க முடியாது, இது தமனிக்கும் கொரோனா வைரஸுக்கும் இடையிலான ஒற்றுமையைக் கணக்கில் எடுத்துக்கொள்கிறது. NiRAN டொமைன் அதன் வரம்பில் உள்ளது.வரிசை அடிப்படையிலான ஒப்பீடு (16).Mg2+ ஐ இணை காரணியாகப் பயன்படுத்தும் சூடோகினேஸ் SelO உடன் ஒப்பிடும்போது, ​​கொரோனா வைரஸ் மற்றும் தமனி வைரஸ் NiRAN இன் செயல்பாடு Mn2+ (16) ஐச் சார்ந்தது (படம் 3C மற்றும் SI பின்னிணைப்பு, படம் S1).Mn2+ சார்பு மற்றும் UTPக்கான வெளிப்படையான விருப்பம் ஆகியவை புரதம் NMPylators இன் அசாதாரண அம்சமாகும், மேலும் இது சமீபத்தில் சால்மோனெல்லா டைபிமுரியத்தின் YdiU புரதத்தில் உறுதிப்படுத்தப்பட்டுள்ளது, இது அழுத்த தூண்டுதலில் இருந்து செல்களைப் பாதுகாக்க Mn2+ சார்ந்த புரதச் சாப்பரோன் UMPylation வினையூக்கி (செல் ATP பூல்) 33)

கொரோனா வைரஸ் NiRAN டொமைன் மற்றும் செல்லுலார் புரோட்டீன் கைனேஸ்கள் (17, 19) ஆகியவற்றுக்கு இடையே சமீபத்தில் விவரிக்கப்பட்ட கட்டமைப்பு ஒற்றுமை, இந்த ஆய்வில் நாங்கள் புகாரளித்த பிற புரதங்களுடன் NMP ஐ இணையாக இணைக்கும் NiRAN இன் திறனுக்கு கூடுதல் ஆதரவை வழங்குகிறது.HCoV-229E ORF1a ஆல் குறியிடப்பட்ட புரதங்களில் சாத்தியமான NiRAN இலக்குகளுக்கான எங்கள் தேடலை நாங்கள் கவனம் செலுத்தினோம், அவை RTC இன் ORF1b-குறியீடு செய்யப்பட்ட பிரதிகளுக்கு நேரடியாகவோ அல்லது மறைமுகமாகவோ உதவுவதாக அறியப்படுகிறது (12, 35).எங்கள் சோதனைகள் nsp9 இன் பயனுள்ள மற்றும் குறிப்பிட்ட NMPylationக்கான உறுதியான ஆதாரங்களை வழங்குகின்றன (படம் 2).இலக்குப் புரதமானது, நொதியை விட (என்எஸ்பி12) 8 முதல் 10 மடங்கு அதிகமான மோலார் மிகுதியாகப் பயன்படுத்தப்பட்டால், அது என்எஸ்பி9 முற்றிலும் (மோனோ)என்எம்பி மயமாக்கப்பட்டது (படம் 4) என்பது உறுதி செய்யப்படுகிறது.nsp12 மற்றும் nsp9 ஆகியவற்றுக்கு இடையேயான தொடர்பு குறுகிய காலமே என்றும் nsp9 உடன் நிலையான வளாகத்தை உருவாக்காது என்றும் முடிவு செய்தோம் (பிற RTC துணைக்குழுக்கள் இல்லாத நிலையில்).இந்த முடிவு SARS-CoV புரோட்டியோமின் (35) புரத தொடர்பு ஆய்வுகளால் ஆதரிக்கப்படுகிறது.MS பகுப்பாய்வு nsp9 இன் N-டெர்மினல் எச்சத்தின் முதன்மை அமீனை NMPylation தளமாக அடையாளம் கண்டுள்ளது (SI பின்னிணைப்பு, படம் S5).பாஸ்போராமிடேட் பிணைப்பு மற்றும் N-டெர்மினல் அமினோ குழுவின் உருவாக்கம் NiRAN-மத்தியஸ்த NMPylation செயல்பாட்டை சூடோமோனாஸ் சிரிங்கே SelO-மத்தியஸ்த AMPylation எதிர்வினையிலிருந்து வேறுபடுத்துகிறது, இது Ser, Thr அல்லது Tyr எச்சங்களில் O-இணைக்கப்பட்ட AMP உருவாவதை ஊக்குவிக்கிறது. 22), மற்றும் S. டைபிமுரியம் YdiU ஆனது O-இணைக்கப்பட்ட (டைருடன்) மற்றும் N-இணைக்கப்பட்ட (அவருடன்) பெப்டைட்-UMP சேர்க்கைகளை உருவாக்குகிறது.புரதங்களின் SelO குடும்பத்தில் கிடைக்கும் வரையறுக்கப்பட்ட தகவல்கள், இந்த பெரிய புரதக் குடும்பத்தின் உறுப்பினர்கள் பெப்டைட்-என்எம்பி சேர்க்கைகளை உருவாக்குவதில் பெரிதும் வேறுபடுகிறார்கள் என்பதைக் குறிக்கிறது.இது ஒரு சுவாரஸ்யமான அவதானிப்பு, இது மேலதிக ஆய்வுக்கு தகுதியானது.

இந்த ஆய்வில் பெறப்பட்ட தரவு, nsp9 இன் NMPylation க்கு இலவச N-டெர்மினஸ் தேவை என்று அனுமானிக்க வழிவகுத்தது.வைரஸ் நகலெடுக்கும் சூழலில், இது Mpro மற்றும் pp1ab ஆல் மத்தியஸ்தம் செய்யப்பட்ட பாலிபுரோட்டீன் pp1a பிரதியில் nsp8|nsp9 செயலாக்க தளத்தின் புரோட்டியோலிடிக் பிளவு மூலம் வழங்கப்படும்.பெரும்பாலான கொரோனா வைரஸ்களில், இந்த குறிப்பிட்ட தளம் (VKLQ|HCoV-229E இல் NNEI) மற்றும் பிற அனைத்து கொரோனா வைரஸ் Mpro பிளவு தளங்களுக்கும் இடையே உள்ள வித்தியாசம் Asn (அலா, Ser அல்லது Gly போன்ற மற்றொரு சிறிய எச்சத்தை விட) P1â ஆக்கிரமித்துள்ளதா???இடம் (36).ஆரம்பகால ஆய்வுகளில் பெறப்பட்ட பெப்டைட் பிளவு தரவு மற்ற தளங்களை விட nsp8|nsp9 தளத்தின் பிளவு திறன் குறைவாக இருப்பதாகக் காட்டியது, 1) இந்த குறிப்பிட்ட தளம் C-டெர்மினலின் சரியான நேரத்தில் ஒருங்கிணைக்கப்பட்ட செயலாக்கத்தில் ஒழுங்குமுறை பங்கைக் கொண்டிருக்கக்கூடும் என்பதைக் குறிக்கிறது. pp1a பகுதி, அல்லது 2) a வைரஸ் பிரதியெடுப்பில் சிறப்புப் பாதுகாக்கப்பட்ட nsp9 N-டெர்மினஸின் பங்கு (37).எங்கள் தரவு (படம் 5A) உண்மையான N-டெர்மினல் வரிசையைச் சுமக்கும் nsp9 இன் மறுசீரமைப்பு வடிவம் nsp12 ஆல் திறம்பட NMP மயமாக்கப்பட்டது என்பதைக் காட்டுகிறது.காரணி Xa (nsp9-His6; SI பின்னிணைப்பு, அட்டவணை S1) அல்லது Mpro-மத்தியஸ்த பிளவு (nsp7-11-His6; படம் 5A மற்றும் SI பின்னிணைப்பு, அட்டவணை S1) மூலம் N-டெர்மினல் பக்கவாட்டு வரிசை அகற்றப்பட்டது.முக்கியமாக, வெட்டப்படாத nsp9-கொண்ட முன்னோடி nsp7-11-His6 nsp12 இன் NMPylation க்கு எதிர்ப்பைக் காட்டியது, இது எங்கள் தரவுகளுடன் ஒத்துப்போகிறது, nsp9-NMP சேர்க்கையானது N-டெர்மினல் ப்ரைமரி அமீன் (SI பின்னிணைப்பு, படம் S5) மூலம் உருவாகிறது என்பதைக் குறிக்கிறது. .NiRAN அடி மூலக்கூறு விவரக்குறிப்பைப் பற்றிய ஆழமான புரிதலைப் பெற, நாங்கள் nsp9 இன் அருகிலுள்ள N- முனைய எச்சங்களில் கவனம் செலுத்தினோம்.மற்ற புரதங்கள் இல்லாத நிலையில், அவை கட்டமைப்பு ரீதியாக நெகிழ்வானவை, அவை nsp9 (26 28, 38) இன் பெயரிடப்படாத வடிவத்தில் கண்டறியப்படுவதைத் தடுக்கின்றன, அவற்றின் வரையறுக்கப்பட்ட இயற்கை மாறுபாட்டைக் குறிக்கிறது, இது முக்கியமான வரிசை-குறிப்பிட்ட (இரண்டாம் கட்டமைப்பு தொடர்பானது அல்ல) nsp9 N-டெர்மினல் துண்டின் செயல்பாடு.இந்த பகுதியில் பாதுகாக்கப்பட்ட எச்சங்களின் ஆலா மாற்றீடுகள் (புள்ளிவிவரங்கள் 5C மற்றும் D மற்றும் SI பின்னிணைப்பு, படம் S8) விட்ரோவில் nsp9 NMPylation க்கு N3826 இன்றியமையாதது என்பதை வெளிப்படுத்துகிறது, அதே நேரத்தில் N3825A மற்றும் E3827A மாற்றீடுகள் NMPylation குறைவதற்கு வழிவகுக்கும், அதேசமயம் M3820A மற்றும் P3820A மாற்றீடுகள் இல்லை. .nsp9 NMPylation ஐ வெளிப்படையாகப் பாதிக்கும்.N-டெர்மினல் Asn (N3825A, N3825S) இன் மாற்றீடு nsp9 NMPylation மற்றும் செல் கலாச்சாரத்தில் வைரஸ் பிரதிபலிப்பு (படம் 5C மற்றும் D) ஆகியவற்றில் ஒரு மிதமான விளைவை மட்டுமே கொண்டிருந்தாலும், N-டெர்மினல் 3825-NN டிபெப்டைடில் இருந்து Asn எச்ச வரிசையை நீக்குகிறது. இது வைரஸ்களுக்கு ஆபத்தானது என்று நிரூபிக்கப்பட்டது, இது N-டெர்மினஸில் மற்றொரு எச்சத்திற்கு முன் ஒரு Asn எச்சம் தேவைப்படுகிறது என்பதைக் குறிக்கிறது, முன்னுரிமை Asn, இருப்பினும் இதே போன்ற எச்சங்களை ஓரளவு பொறுத்துக்கொள்ள முடியும் என்று தோன்றுகிறது (படம் 5B, C, மற்றும் D).3825-NN டிபெப்டைட், குறிப்பாக கொரோனா வைரஸ் வரம்பில் உள்ள பாதுகாக்கப்பட்ட மற்றும் அத்தியாவசியமான N3826 எச்சம் (SI பின்னிணைப்பு, படம் S6), NiRAN இன் செயலில் உள்ள தளத்தில் nsp9 N-டெர்மினஸின் சரியான பிணைப்பு மற்றும் நோக்குநிலையை உறுதி செய்கிறது.

அனைத்து துணைக் குடும்பங்களின் பாதுகாக்கப்பட்ட Glu க்கு மாற்றாக Ala (E3827A) ஆனது விட்ரோவில் nsp9 NMPylation ஐத் தக்கவைக்கிறது, ஆனால் செல் கலாச்சாரத்தில் வைரஸ்களுக்கு ஆபத்தானது (படம் 5C மற்றும் D), இந்த எச்சத்தின் கூடுதல் செயல்பாட்டைக் குறிக்கிறது, எடுத்துக்காட்டாக, முக்கிய தொடர்புகளில் (NMPylated அல்லது மாற்றப்படாதது). ) nsp9 N-டெர்மினஸ் மற்றும் வைரஸ் நகலெடுப்பதில் ஈடுபட்டுள்ள பிற காரணிகள்.Nsp9 பிறழ்வுகள் nsp9 இன் புரோட்டியோலிடிக் செயல்முறையை பாதிக்கவில்லை அல்லது அருகிலுள்ள nsps (39) (SI பின் இணைப்பு, படம் S9), கவனிக்கப்பட்ட பல nsp9 பிறழ்வுகளின் ஆபத்தான பினோடைப்கள் C புரோட்டியோலிடிக் செயல்முறை-டெர்மினல் pp1a பகுதியின் ஒழுங்குபடுத்தலினால் ஏற்படவில்லை என்பதைக் குறிக்கிறது. .

pp1a/pp1ab இல் nsp8|9 க்ளீவேஜ் தளத்தின் Mpro-மத்தியஸ்த சிகிச்சைக்குப் பிறகு, nsp9 இன் N-டெர்மினஸ் UMPylated (அல்லது மற்றொரு NMP உடன் ஓரளவு மாற்றியமைக்கப்படலாம்) என்பதற்கு மேலே உள்ள தரவு ஆதாரங்களை வழங்குகிறது.கூடுதலாக, nsp9 இன் N-டெர்மினஸின் சிறந்த பாதுகாப்பு (கொரோனா வைரஸ் குடும்பத்தில் உள்ள ஒற்றை மற்றும் மாறாத Asn எச்சங்கள் உட்பட) மற்றும் இந்த ஆய்வில் பெறப்பட்ட தலைகீழ் மரபியல் தரவு (புள்ளிவிவரங்கள் 3E மற்றும் 5D) விவரிக்கப்பட்ட nsp9 NMPylation என்று முடிவு செய்ய வழிவகுத்தது. உயிரியல் ரீதியாக தொடர்புடையது மற்றும் கொரோனா வைரஸ் நகலெடுப்பிற்கு அவசியம்.இந்த மாற்றத்தின் செயல்பாட்டு விளைவுகள் ஆய்வு செய்யப்பட உள்ளன, எடுத்துக்காட்டாக, முன்னர் விவரிக்கப்பட்ட (குறிப்பிடப்படாத) nsp9 (மாற்றப்படாத வடிவம்) RNA பிணைப்பு செயல்பாடு (2628).N-டெர்மினல் NMPylation புரதம் அல்லது RNA அடி மூலக்கூறுகளுடன் nsp9 இன் தொடர்பு அல்லது வெவ்வேறு நான்கு-நிலை கூட்டங்களை உருவாக்குவதையும் பாதிக்கலாம்.இவை கட்டமைப்பு ஆய்வுகளில் கவனிக்கப்பட்டு, கொரோனா வைரஸ் நகலெடுப்புடன் செயல்பாட்டுடன் தொடர்புடையதாக உறுதிப்படுத்தப்பட்டுள்ளது, இருப்பினும் குறிப்பாக இந்த மாற்றம் இல்லாத நிலையில் (26- ââ29, 40).

கொரோனா வைரஸ் NiRAN டொமைனின் இலக்கு விவரக்குறிப்பு இன்னும் விரிவாக வகைப்படுத்தப்பட வேண்டியிருந்தாலும், கொரோனா வைரஸ் NiRAN டொமைனின் புரத இலக்கு விவரக்குறிப்பு மிகவும் குறுகியதாக இருப்பதை எங்கள் தரவு காட்டுகிறது.அனைத்து நிடோவைரஸ் குடும்பங்களின் NiRAN டொமைனில் உள்ள முக்கிய செயலில் உள்ள தள எச்சங்களின் பாதுகாப்பு (8, 16) பாதுகாக்கப்பட்ட NMPylator இந்த புரதங்களின் செயல்பாட்டை வலுவாக ஆதரிக்கிறது என்றாலும், இந்த டொமைனின் அடி மூலக்கூறு பிணைப்பு பாக்கெட் எச்சங்களின் அடையாளம் வகைப்படுத்தப்பட வேண்டும் பாதுகாப்பு மற்றும் பாதுகாப்பு , மற்றும் Nidovirales நோக்கங்களின் வெவ்வேறு குடும்பங்களுக்கு இடையே வேறுபடலாம்.இதேபோல், பிற உள்ளமை வைரஸ்களின் தொடர்புடைய இலக்குகள் இன்னும் தீர்மானிக்கப்படவில்லை.அவை nsp9 அல்லது பிற புரதங்களின் ரிமோட் ஆர்த்தோலாக்களாக இருக்கலாம், ஏனெனில் பொதுவாக உள்ளமைக்கப்பட்ட வைரஸ்களில் பாதுகாக்கப்படும் ஐந்து பிரதி களங்களுக்கு வெளியே உள்ள தொடர்கள் குறைவாகப் பாதுகாக்கப்படுகின்றன (8), Mpro மற்றும் NiRAN இடையே உள்ள மரபணு வரிசை உட்பட, அவற்றில், nsp9 இல் அமைந்துள்ளது கொரோனா வைரஸ்.

கூடுதலாக, NiRAN டொமைன் கூடுதல் (செல்லுலார் உட்பட) இலக்குகளைக் கொண்டிருப்பதற்கான சாத்தியக்கூறுகளை நாங்கள் தற்போது நிராகரிக்க முடியாது.இந்த வழக்கில், இந்த வளர்ந்து வரும் புரதம் NMPylators (NMPylators) (30, 31) இல் உள்ள பாக்டீரியா ஹோமோலாக்ஸ்கள் "மாஸ்டர் ரெகுலேட்டர்கள்" இருப்பதாகத் தெரிகிறது என்பதைக் குறிப்பிடுவது மதிப்பு?NMP பல்வேறு செல்லுலார் புரோட்டீன்களை அவற்றின் கீழ்நிலை செயல்பாடுகளை ஒழுங்குபடுத்த அல்லது நீக்குகிறது, இதன் மூலம் செல்லுலார் ஸ்ட்ரெஸ் ரெஸ்பான்ஸ் மற்றும் ரெடாக்ஸ் ஹோமியோஸ்டாஸிஸ் (22, 33) போன்ற பல்வேறு உயிரியல் செயல்முறைகளில் பங்கு வகிக்கிறது.

இந்த ஆய்வில் (புள்ளிவிவரங்கள் 2 மற்றும் 4 மற்றும் SI பின்னிணைப்பு, புள்ளிவிவரங்கள் S3 மற்றும் S5), nsp12 UMP (NMP) பகுதியை nsp9 இல் ஒற்றை (பாதுகாக்கப்பட்ட) நிலைக்கு மாற்றியது என்பதை எங்களால் நிரூபிக்க முடிந்தது, மற்ற புரதங்கள் இதில் மாற்றப்படவில்லை நிபந்தனைகளின் கீழ், நன்கு வரையறுக்கப்பட்ட (தளர்வானதை விட) அடி மூலக்கூறு விவரக்குறிப்பு ஆதரிக்கப்படுகிறது.இதனுடன் இணங்க, N-டெர்மினல் nsp9 NMPylation உடன் ஒப்பிடும்போது, ​​nsp12′ன் சொந்த NMPylation செயல்பாடு மிகவும் குறைவாக உள்ளது, அதைக் கண்டறிவதற்கு நீண்ட ஆட்டோரேடியோகிராஃபி வெளிப்பாடு நேரம் தேவைப்படுகிறது, மேலும் nsp12 செறிவில் 10 மடங்கு அதிகரிப்பு பயன்படுத்தப்படுகிறது.கூடுதலாக, எங்கள் MS பகுப்பாய்வு nsp12 இன் NMPylationக்கான ஆதாரங்களை வழங்கத் தவறிவிட்டது, இது NiRAN டொமைன் சுய-NMPylation (சிறந்தது) ஒரு இரண்டாம் நிலைச் செயல்பாடு என்று பரிந்துரைக்கிறது.இருப்பினும், பிற ஆய்வுகள் பாக்டீரியல் NMPylator இன் சுய-AMPylation நிலை மற்ற புரத அடி மூலக்கூறுகளில் (22, 33) அவற்றின் NMPylation செயல்பாட்டைக் கட்டுப்படுத்தலாம் என்பதற்கான ஆரம்ப ஆதாரங்களை வழங்கியுள்ளன என்பதைக் கவனத்தில் கொள்ள வேண்டும்.எனவே, EAV nsp9 (16) மற்றும் கொரோனா வைரஸ் nsp12 (இந்த ஆய்வு), C-டெர்மினல் RdRp டொமைன் (C-terminal RdRp டொமைன்) மடிப்பில் முன்மொழியப்பட்ட சாப்பரோன் போன்ற விளைவு உட்பட, சுய-NMPylation நடவடிக்கைகளின் சாத்தியமான செயல்பாட்டு விளைவுகளை ஆராய கூடுதல் ஆராய்ச்சி தேவை. 16)).

முன்னதாக, நிடோவைரல் நிரான் டொமைனின் சாத்தியமான கீழ்நிலை செயல்பாடுகள் தொடர்பான பல கருதுகோள்கள் பரிசீலிக்கப்பட்டன, இதில் ஆர்என்ஏ லிகேஸ், ஆர்என்ஏ-கேப்டு குவானிலேட் டிரான்ஸ்ஃபரேஸ் மற்றும் புரோட்டீன் ப்ரைமிங் செயல்பாடு (16) ஆகியவை அடங்கும், ஆனால் அவை எதுவும் கிடைக்கக்கூடிய கீழ்நிலை செயல்பாடுகளுடன் இணங்கவில்லை.பின்வரும் நிலைகளில் பெறப்பட்ட தகவல்கள் கூடுதல் அனுமானங்களைச் செய்யாமல் சரியாக அதே நேரத்தில் இருக்கும்.இந்த ஆய்வில் பெறப்பட்ட தரவு, புரதத்தால் தூண்டப்பட்ட RNA தொகுப்பின் துவக்கத்தில் NiRAN டொமைன் ஈடுபட்டுள்ளது என்பதோடு மிகவும் ஒத்துப்போகிறது (ஆனால் நிரூபிக்க முடியவில்லை).NiRAN டொமைனின் செயல்பாடு 5 இல் இருக்கும் என்று முன்பு நம்பப்பட்டது??²-ஆர்என்ஏ கேப்பிங் அல்லது ஆர்என்ஏ பிணைப்பு எதிர்வினைகள் இவை மற்றும் பிற தரவுகளின் ஆதரவால் பாதிக்கப்படாது.எனவே, எடுத்துக்காட்டாக, NiRAN இன் செயலில் உள்ள தளமானது பாதுகாக்கப்பட்ட Asp ஐ ஒரு பொது தளமாக உள்ளடக்கியதாகக் கருதப்படுகிறது (சூடோமோனாஸ் சிரிங்கே SelO இல் D252; HCoV-229E pp1ab இல் D4271; SARS-CoV-2 nsp12 இல் D208) (SI பின் இணைப்பு 2, படம் 2 )S2) (17, 22, 33), அதே சமயம் ATP-சார்ந்த RNA லிகேஸ் மற்றும் RNA கேப்பிங் என்சைமில் உள்ள வினையூக்கம் கோவலன்ட் என்சைம்-(lysyl-N)-NMP இடைநிலை மூலம் மேற்கொள்ளப்படுகிறது, இதில் மாற்றப்படாத Lys எச்சம் ( 41)கூடுதலாக, பாதுகாக்கப்பட்ட புரத இலக்குகளுக்கான கொரோனா வைரஸ் NiRAN இன் குறிப்பிடத்தக்க வரிசை அடிப்படையிலான விவரக்குறிப்பு மற்றும் NTP இணை-அடி மூலக்கூறுகளுக்கான தளர்வான விவரக்குறிப்பு (UTP ஐ விரும்புகிறது) NiRAN-மத்தியஸ்த கேப்பிங் என்சைம் அல்லது RNA லிகேஸ் போன்ற செயல்பாடுகளை எதிர்க்கிறது.

வெளிப்படையாக, சரிபார்க்க நிறைய கூடுதல் வேலை தேவைப்படுகிறது மற்றும் நிரூபிக்கப்பட்டால், புரதத்தால் தூண்டப்பட்ட RNA தொகுப்பில் nsp9-UMP (nsp9-NMP) இன் சாத்தியமான பங்கை விவரிக்கவும், இது பல சுவாரஸ்யமான ஆனால் (இதுவரை) அறிக்கைகளை இணைக்கும். .தனிமைப்படுத்தப்பட்ட அவதானிப்புகள்.எடுத்துக்காட்டாக, கொரோனா வைரஸின் நெகடிவ்-ஸ்ட்ராண்ட் ஆர்என்ஏவின் முடிவு ஒலிகோ(யு) இழையுடன் (42, 43) தொடங்குகிறது என்று தீர்மானிக்கப்பட்டது.இந்த அவதானிப்பு எதிர்மறை-ஸ்ட்ராண்ட் ஆர்என்ஏவின் தொகுப்பு nsp9 இன் UMPylated வடிவத்தை பாலி(A) வால் (தூண்டுதல்) உடன் பிணைப்பதன் மூலம் தொடங்கப்படுகிறது என்ற கருத்துடன் ஒத்துப்போகிறது. மற்றொரு RTC புரதம்.nsp9 வழங்கிய UMP பகுதியை nsp7/8/nsp12-மத்தியஸ்த ஒலிகோரிடைலேஷனுக்கான “ப்ரைமராக” பயன்படுத்தலாம், மரபணு ஆர்என்ஏவில் உள்ள 3??²-பாலி(A) வால் அல்லது மற்றொரு ஒலிகோ (A)-கொண்ட வரிசையைப் பயன்படுத்தி பைகார்னாவைரஸ் VPg புரதத்திற்காக (44) நிறுவப்பட்ட பொறிமுறையைப் போலவே, ஒரு டெம்ப்ளேட்டாக செயல்படுகிறது.முன்மொழிவு "நெறிமுறையற்றது" என்றால் என்ன செய்வது????(புரதத்தால் தூண்டப்பட்ட) நெகடிவ்-ஸ்ட்ராண்ட் ஆர்என்ஏ தொகுப்பின் துவக்கமானது அவதானிப்புகளுக்கு ஒரு இணைப்பை வழங்குகிறது, இது கொரோனா வைரஸ் நெகடிவ்-ஸ்ட்ராண்ட் ஆர்என்ஏ அதன் முடிவில் (42) UMP (UTPக்கு பதிலாக) இருப்பதைக் குறிக்கிறது. நியூக்ளிக் அமிலம் டைசர் ஒரு அறியப்படாத யூரிடின்-குறிப்பிட்ட எண்டோநியூக்லீஸால் பாஸ்போரிலேட்டட் முடிவை பிளவுபடுத்துகிறது.உறுதிசெய்யப்பட்டால், இந்த நியூக்ளிக் அமிலம் ஹைட்ரோலைடிக் செயல்பாடு nsp9 இன் ஒலிகோமெரிக் UMPylated வடிவத்தை 5² nascent எதிர்மறை இழையின் முடிவில் இருந்து வெளியிட உதவும்.புரோட்டீன் ப்ரைமிங்கில் nsp9 இன் சாத்தியமான பங்கு முந்தைய தலைகீழ் மரபியல் ஆய்வுகளுடன் ஒத்துப்போகிறது, இது nsp9 (மற்றும் nsp8) கொரோனா வைரஸ் மரபணுவின் 3 முனைக்கு அருகில் பாதுகாக்கப்பட்ட சிஸ்-ஆக்டிங் ஆர்என்ஏ உறுப்புடன் விமர்சன ரீதியாகவும் குறிப்பாகவும் தொடர்பு கொள்கிறது என்பதைக் காட்டுகிறது.45)இந்த அறிக்கையின்படி, இந்த முந்தைய அவதானிப்புகளை இப்போது மறுபரிசீலனை செய்து மேலும் ஆராய்ச்சி மூலம் விரிவாக்கலாம்.

சுருக்கமாக, N-டெர்மினஸில் RdRp உடன் இணைக்கப்பட்ட தனியுரிம உள்ளமை வைரஸ் என்சைம் குறிச்சொல்லின் குறிப்பிட்ட செயல்பாட்டை எங்கள் தரவு தீர்மானித்தது.கொரோனா வைரஸில், புதிதாகக் கண்டுபிடிக்கப்பட்ட NiRAN-மத்தியஸ்த UMPylator/NMPylator செயல்பாடு Mn2+ மற்றும் அருகிலுள்ள Asn எச்சங்களை நம்பி, N-டெர்மினல் முதன்மை அமினுடன் (குறைந்த ஆற்றல்) பாஸ்போராமைடேட் பிணைப்புகளை உருவாக்குவதற்குப் பயன்படுத்தப்படுகிறது.nsp8|9 க்ளீவேஜ் தளத்தில் உள்ள Mpro-மத்தியஸ்த பிளவு மூலம், nsp9 இலக்கை NMPylationக்கு பயன்படுத்தலாம், இது புரோட்டீஸ் மற்றும் NiRAN டொமைனுக்கு இடையேயான செயல்பாட்டு இணைப்பைக் குறிக்கிறது, இது RdRp வரை நீட்டிக்கப்படுகிறது.nsp12 NiRAN செயலில் உள்ள தளத்தின் முக்கிய எச்சங்களின் பாதுகாப்பு மற்றும் nsp9 இலக்கு, SARS-CoV-2 உட்பட இரண்டு கொரோனா வைரஸ்களிலிருந்து பெறப்பட்ட தரவுகளுடன் இணைந்து, nsp9 NMPylation ஒரு கொரோனா வைரஸ் கன்சர்வேடிவ் அம்சங்களும் வைரஸ் நகலெடுப்பதில் ஒரு முக்கிய படியாகும் என்பதற்கு வலுவான சான்றுகளை வழங்குகிறது.புரதத்தால் தூண்டப்பட்ட RNA தொகுப்பில் NMP9 இன் NMPylated வடிவத்தின் குறிப்பிட்ட பங்கு கொரோனா வைரஸ் மற்றும் பிற உள்ளமை வைரஸ்களுக்கு ஒரு நியாயமான காட்சியாகும், மேலும் NiRAN மற்ற அடையாளம் காணப்படாத புரதங்களையும் குறிவைக்கலாம் என்ற முடிவுக்கு கிடைக்கக்கூடிய தரவு நம்மை வழிநடத்துகிறது.வைரஸை ஒழுங்குபடுத்துங்கள்.புரவலன் தொடர்பு.உறுதிப்படுத்தப்பட்டால், வைரஸ் ஆர்என்ஏ தொகுப்பில் புரோட்டீன் ப்ரைமர்களின் ஈடுபாடு, முன்னர் கண்டறியப்பட்ட கொரோனா வைரஸ் மற்றும் பிகோர்னாவைரஸ் போன்ற சூப்பர் குரூப் (9) ஆகியவற்றுக்கு இடையேயான Mpro/3CLpro மற்றும் RdRp டொமைன்களின் தொடர் தொடர்பை அதிகரிக்கும் (9). 46) பிரிவில்.

இந்த ஆய்வில் அடையாளம் காணப்பட்ட அடிப்படை, தேர்ந்தெடுக்கப்பட்ட மற்றும் பழமைவாத என்சைம் செயல்பாடுகள் வைரஸ் எதிர்ப்பு மருந்துகளுக்கான இலக்குகளாகப் பயன்படுத்தப்படலாம் என்பதையும் எங்கள் தரவு காட்டுகிறது.NiRAN இன் செயலில் உள்ள தளத்தில் பாதுகாக்கப்பட்ட nsp9 N-டெர்மினஸின் பிணைப்பில் குறுக்கிடும் (மற்றும் அடுத்தடுத்த மாற்றம்) பல்வேறு (துணை) வகை நோய்த்தொற்றுகளிலிருந்து விலங்கு மற்றும் மனித கொரோனா வைரஸ்களுக்கு சிகிச்சையளிக்க பொருத்தமான மற்றும் பல்துறை வைரஸ் தடுப்பு மருந்துகளாக உருவாக்கப்படலாம். SARS-CoV-2 மற்றும் மத்திய கிழக்கு சுவாச நோய்க்குறி கொரோனா வைரஸ் உட்பட.

இந்த ஆய்வில் தயாரிக்கப்பட்ட கொரோனா வைரஸ் புரதத்தின் குறியீட்டு வரிசையானது RT-PCR ஆல் HCoV-229E அல்லது SARS-CoV-2 நோயால் பாதிக்கப்பட்ட Vero E6 நோயால் பாதிக்கப்பட்ட Huh-7 இலிருந்து தனிமைப்படுத்தப்பட்ட RNA ஐப் பயன்படுத்தி பெருக்கி, நிலையான குளோனிங் நடைமுறைகளைப் பயன்படுத்தி செருகப்பட்டது.pMAL-c2 (புதிய இங்கிலாந்து உயிரியல் ஆய்வகம்) அல்லது pASK3-Ub-CHis6 (47) வெளிப்பாடு திசையன் (SI பின் இணைப்பு, அட்டவணைகள் S1 மற்றும் S2).ஒற்றை கோடான் மாற்றீடுகள் PCR-அடிப்படையிலான தளம்-இயக்கிய பிறழ்வு உருவாக்கத்தால் அறிமுகப்படுத்தப்பட்டன (48).MBP இணைவு புரதத்தை உருவாக்க, E. coli TB1 செல்கள் பொருத்தமான pMAL-c2 பிளாஸ்மிட் கட்டமைப்புடன் மாற்றப்பட்டன (SI பின்னிணைப்பு, அட்டவணை S1).இணைவு புரதம் அமிலோஸ் அஃபினிட்டி குரோமடோகிராபி மூலம் சுத்திகரிக்கப்பட்டது மற்றும் Xa காரணியுடன் பிளவுபடுத்தப்பட்டது.பின்னர், சி-டெர்மினல் ஹிஸ்6-டேக் செய்யப்பட்ட புரதமானது, முன்பு விவரிக்கப்பட்டபடி Ni-immobilized metal affinity chromatography (Ni-IMAC) மூலம் சுத்திகரிக்கப்பட்டது (49).ubiquitin ஃப்யூஷன் புரதத்தை உருவாக்க, E. coli TB1 செல்கள் பொருத்தமான pASK3-Ub-CHis6 பிளாஸ்மிட் கன்ஸ்ட்ரக்ட் (SI பின்னிணைப்பு, அட்டவணைகள் S1 மற்றும் S2) மற்றும் pCGI பிளாஸ்மிட் DNA என்கோடிங் ubiquitin-specific C-terminal hydrolase 1 (Ubp1) ஆகியவற்றைப் பயன்படுத்தியது.மாற்றம் (47).சி-டெர்மினல் His6-குறியிடப்பட்ட கொரோனா வைரஸ் புரதம் முன்பு விவரிக்கப்பட்டபடி சுத்திகரிக்கப்பட்டது (50).

EAV nsp9 (16) இல் விவரிக்கப்பட்டுள்ளபடி HCoV-229E nsp12-His6 இன் சுய-NMPylation சோதனை செய்யப்பட்டது.சுருக்கமாக, nsp12-His6 (0.5 µM) இல் 50 mM 4-(2-ஹைட்ராக்சிதைல்)-1-piperazineethanesulfonic அமிலம் (HEPES)-KOH, pH 8.0, 5 mM dithiothreitol (DTT), 6 mM MnCl2, buffer inc25 குறிப்பிடப்பட்ட NTP மற்றும் 0.17 µM 30 நிமிடங்களுக்கு 30 °C இல் [α32-P]NTP (3,000 Ci/mmol; Hartmann Analytic) பொருத்தப்பட்டது.nsp12-மத்தியஸ்த nsp9 NMPylation இன் மற்ற அனைத்து (நிலையான) NMPylation மதிப்பீடுகளிலும், எதிர்வினை நிலைமைகள் பின்வருமாறு சரிசெய்யப்படுகின்றன: nsp12-His6 (0.05 µM) மற்றும் nsp9-His6 (4 µM) 50 mM HEPES-KOH (HEPES-KOH) முன்னிலையில். ), 5 mM DTT, 1 mM MnCl2, 25 µM சுட்டிக்காட்டப்பட்ட NTP, மற்றும் 0.17 µM பொருந்திய [α32-P]NTP.30 டிகிரி செல்சியஸ் வெப்பநிலையில் 10 நிமிடங்கள் அடைகாத்த பிறகு, எதிர்வினை மாதிரி SDS-PAGE மாதிரி இடையகத்துடன் கலக்கப்பட்டது: 62.5 mM டிரிஸ்(ஹைட்ராக்ஸிமெதில்) அமினோமெத்தேன் HCl (pH 6.8), 100 mM DTT, 2.5% SDS, 10% கிளிசரால் மற்றும் 0.0005% நீலம்.5 நிமிடங்களுக்கு 90 °C க்கு சூடாக்குவதன் மூலம் புரதம் குறைக்கப்பட்டது மற்றும் 12% SDS-PAGE மூலம் பிரிக்கப்பட்டது.கூமாஸ்ஸி பிரில்லியன்ட் ப்ளூ கரைசல் (40% மெத்தனால், 10% அசிட்டிக் அமிலம், 0.05% கூமாஸ்ஸி பிரில்லியன்ட் ப்ளூ ஆர்-250), நிறமாற்றம் செய்யப்பட்டு, பாஸ்போரெசென்ட் இமேஜிங் திரையில் 20 மணிநேரம் (NMPylation இலிருந்து nsp12 ஐக் கண்டறிய) ஜெல் நிலையானது மற்றும் கறை படிந்துள்ளது. அல்லது (அதிகபட்சம்) 2 மணிநேரம் (nsp9 NMPylation மதிப்பிட).திரையை ஸ்கேன் செய்ய டைஃபூன் 9200 இமேஜர் (ஜிஇ ஹெல்த்கேர்) பயன்படுத்தப்பட்டது மற்றும் சிக்னல் தீவிரத்தை பகுப்பாய்வு செய்ய ImageJ பயன்படுத்தப்பட்டது.

MS பகுப்பாய்விற்கு, NMPylation பகுப்பாய்வில் 1 µM nsp12-His6 மற்றும் 10 µM nsp9 (ஹெக்ஸாஹிஸ்டிடின் டேக் இல்லாமல்) பயன்படுத்தப்பட்டது (SI பின்னிணைப்பு, அட்டவணை S1) மற்றும் 500 µM UTP மற்றும் GTP ஆகியவற்றின் அதிகரித்த செறிவு பயன்படுத்தப்பட்டது.அவற்றின் செறிவு மற்றும் எதிர்பார்க்கப்படும் புரதத் தரத்தைப் பொறுத்து, மாஸ்பிரெப் நெடுவரிசை (வாட்டர்ஸ்) பொருத்தப்பட்ட வாட்டர்ஸ் அக்விட்டி எச்-கிளாஸ் ஹெச்பிஎல்சி சிஸ்டம் ஆன்லைனில் 1 முதல் 10 μL இடையக புரதக் கரைசல்களை நீக்குவதற்குப் பயன்படுத்தப்பட்டது.உப்பு நீக்கப்பட்ட புரதமானது, பஃபர் ஏ (தண்ணீர்/0.05% ஃபார்மிக் அமிலம்) மற்றும் பஃபர் பி (அசிட்டோனிட்ரைல்/0.045% ஃபார்மிக் அமிலம்) ஆகியவற்றின் பின்வரும் சாய்வு மூலம் சினாப்ட் ஜி2எஸ்ஐ மாஸ் ஸ்பெக்ட்ரோமீட்டரின் (வாட்டர்ஸ்) எலக்ட்ரோஸ்ப்ரே அயன் மூலத்தில் வெளியேற்றப்படுகிறது, மேலும் நெடுவரிசை வெப்பநிலை 60 ° C மற்றும் 0.1 mL/min ஓட்ட விகிதம்: 5% A உடன் 2 நிமிடங்களுக்கு சமச்சீரற்ற முறையில் நீக்கவும், பின்னர் 8 நிமிடங்களுக்குள் 95% B க்கு நேரியல் சாய்வு, மேலும் 4 நிமிடங்களுக்கு 95% B ஐ பராமரிக்கவும்.

500 முதல் 5000 m/z வரை நிறை வரம்பைக் கொண்ட நேர்மறை அயனிகள் கண்டறியப்படுகின்றன.குளு-ஃபைப்ரினோபெப்டைட் B ஆனது ஒவ்வொரு 45 வினாடிகளிலும் தானியங்கி வெகுஜன சறுக்கல் திருத்தத்திற்காக அளவிடப்படுகிறது.MaxEnt1 நீட்டிப்புடன் கூடிய MassLynx இன்ஸ்ட்ரூமென்ட் மென்பொருளைப் பயன்படுத்தி, பேஸ்லைனைக் கழித்து, மென்மையாக்கிய பிறகு சராசரி ஸ்பெக்ட்ரத்தை சிதைக்க வேண்டும்.

UMPylated HCoV-229E nsp9 வரிசைமுறை-தர மாற்றியமைக்கப்பட்ட டிரிப்சின் (சர்வா) சேர்ப்பதன் மூலம் செரிக்கப்பட்டது மற்றும் ஒரே இரவில் 37 °C இல் அடைகாக்கப்பட்டது.ஒரு குரோமாபாண்ட் C18WP ஸ்பின் நெடுவரிசை (பகுதி எண் 730522; மச்செரி-நாகல்) பெப்டைட்களை உப்பு நீக்கவும் மற்றும் செறிவூட்டவும் பயன்படுத்தப்பட்டது.இறுதியாக, பெப்டைட் 25 µL தண்ணீரில் கரைக்கப்பட்டது, அதில் 5% அசிட்டோனிட்ரைல் மற்றும் 0.1% ஃபார்மிக் அமிலம் உள்ளது.

ஆர்பிட்ராப் வெலோஸ் ப்ரோ மாஸ் ஸ்பெக்ட்ரோமீட்டரை (தெர்மோ சயின்டிஃபிக்) பயன்படுத்தி மாதிரிகள் MS ஆல் பகுப்பாய்வு செய்யப்பட்டன.இறுதி nanoâ HPLC அமைப்பு (Dionex), தனிப்பயன் இறுதியில் பொருத்தப்பட்ட 50 செ.மீ ??75 μm C18 RP நெடுவரிசை 2.4 μm காந்த மணிகளால் நிரம்பியுள்ளது (டாக்டர். ஆல்பின் மைஷ் உயர் செயல்திறன் LC GmbH) Proxeon நானோஸ்ப்ரே மூலம் ஆன்லைனில் மாஸ் ஸ்பெக்ட்ரோமீட்டருடன் இணைக்கவும்;6 µL டிரிப்சின் செரிமானக் கரைசலை 300 µm உள் விட்டத்தில் ×??1 செமீ C18 PepMap முன் செறிவு நெடுவரிசை (தெர்மோ சயின்டிஃபிக்).நீர்/0.05% ஃபார்மிக் அமிலத்தை கரைப்பானாகப் பயன்படுத்தி, மாதிரி தானாகவே சிக்கி, 6 µL/min ஓட்ட விகிதத்தில் உப்புநீக்கம் செய்யப்பட்டது.

நீர்/0.05% ஃபார்மிக் அமிலம் (கரைப்பான் A) மற்றும் 80% அசிட்டோனிட்ரைல்/0.045% ஃபார்மிக் அமிலம் (கரைப்பான் B) ஆகியவற்றின் பின்வரும் சாய்வுகள் 300 nL/min ஓட்ட விகிதத்தில் டிரிப்டிக் பெப்டைட்களைப் பிரிக்கப் பயன்படுத்தப்பட்டன: 4% B 5 நிமிடங்கள், பின்னர் 30 A நேரியல் சாய்வு நிமிடங்களில் 45% B ஆகவும், 5 நிமிடங்களுக்குள் 95% கரைப்பான் B ஆகவும் நேரியல் அதிகரிப்பு.குரோமடோகிராஃபிக் நெடுவரிசையை ஒரு துருப்பிடிக்காத எஃகு நானோ-எமிட்டருடன் (ப்ராக்ஸியோன்) இணைக்கவும், மேலும் 2,300 V இன் திறனைப் பயன்படுத்தி மாஸ் ஸ்பெக்ட்ரோமீட்டரின் சூடான தந்துகிக்கு எலுயண்டை நேரடியாக தெளிக்கவும். ஆர்பிட்ராப் மாஸ் அனலைசரில் 60,000 தீர்மானம் கொண்ட சர்வே ஸ்கேன் தொடர்புடையது. குறைந்தபட்சம் மூன்று தரவு MS/MS ஸ்கேன்கள், 30 வினாடிகளுக்கு மாறும் வகையில் விலக்கப்பட்ட, நேரியல் அயன் பொறி மோதல் தூண்டப்பட்ட விலகல் அல்லது ஆர்பிட்ராப் கண்டறிதலுடன் இணைந்து அதிக ஆற்றல் மோதல் விலகலைப் பயன்படுத்தி, தீர்மானம் 7,500 ஆகும்.